iTRAQ/TMT標記定量蛋白質組在非小細胞癌轉移機制新解研究中的應用
百趣生物iTRAQ/TMT標記定量蛋白質組研究是對一個基因組表達的全部蛋白質或一個復雜混
體系內所有蛋白質進行標記，利用標記試劑中的二級報告離子來對蛋白進行精確鑒定和定量。接下來就跟著阿趣一起解讀吧。
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文章標題：Profilin 1 Induces Tumor Metastasis byPromoting Microvesicle Secretion Through the ROCK 1/p-MLC Pathway in Non-SmallCell Lung Cancer
發表期刊：Frontiers in Pharmacology
發表時間：2022.5
影響因子：5.988
合作單位：中南大學湘雅醫院
百趣生物提供服務：TMT標記蛋白組
01摘要
Profilin 1(PFN1)是一種肌動蛋白結合蛋白，在幾種癌癥的轉移中發揮著不同的作用；然而，其在非小細胞肺癌(NSCLC)轉移中的作用仍不清楚。作者應用TMT標記定量蛋白組技術研究其誘導腫瘤轉移的機制。蛋白質組學分析顯示PFN1參與微泡(MV)分泌。與非轉移性NSCLC患者的血清相比，轉移性NSCLC患者的血清中MV的豐度增加。體外和體內實驗均表明，PFN1可以增加MV分泌，并且源自PFN1過表達細胞的MV顯著促進NSCLC轉移。同樣發現PFN1可以與ROCK1相互作用并增強其激酶活性以促進肌球蛋白輕鏈(MLC)磷酸化從而促進MV分泌。ROCK1的抑制降低了MV的分泌并部分逆轉了PFN1誘導的NSCLC轉移的促進作用。總的來說，這些發現表明PFN1調節MV分泌以促進NSCLC轉移。PFN1和MV代表了NSCLC轉移的潛在預測因子或治療靶點。
02實驗結果 1.PFN1與NSCLC 轉移相關，可促進NSCLC細胞體外遷移
為了研究PFN1在NSCLC中的作用，作者采用IHC方法、組織芯片定量等實驗，表明了PFN1參與了NSCLC的轉移，并構建細胞系，通過RT-qPCR和Western檢測過表達和敲除的影響，后又采用傷口愈合和Transwell遷移試驗來確定PFN1對遷移的影響。
圖1. NSCLC組織PFN1的IHC分析圖像/Kaplan–Meier生存分析
2.PFN1可促進NSCLC中Mv的分泌
為了進一步研究EV和PFN1 OE細胞之間的分子差異以及影響NSCLC的可能信號通路。作者利用基于蛋白質組學的方法（TMT定量蛋白質組學）描述它們之間的蛋白質水平。差異蛋白質（DEPs）篩選條件為P值<0.05和倍數變化≤0.83或倍數變化≥1.2。結果確定了581個差異蛋白質，其中327個上調的蛋白質和254個下調的蛋白質（圖2）。
圖2. 差異表達蛋白分析熱圖
接下來，利用富集分析來確定這些DEPs是否可以指向任何特定的生物學功能，從而可以深入了解它們在生物學功能上的差異。GO注釋表明DEPs涉及蛋白質結合、細胞成分組織或生物發生和細胞器組織（圖3）。大多數不同表達的蛋白與細胞器相關，這與PFN1在細胞膜運輸中的作用相一致。同源蛋白群簇(COG/KOG)分析顯示，DEPs參與了翻譯后修飾、蛋白質轉換、伴侶蛋白、細胞內運輸、分泌、囊泡轉運和信號轉導機制（圖4）。通過蛋白質組學分析，我們推斷PFN1可能通過蛋白相互作用和信號轉導參與細胞外囊泡分泌，進而促進NSCLC轉移。
圖3. 差異表達蛋白的GO富集分析
圖4. 差異表達蛋白的COG／KOG分析
由于PFN1在細胞膜運輸中起著重要作用，而MVs是癌癥轉移的關鍵介質，我們從臨床樣本的血清中提取了細胞外囊泡(MVs和外泌體)。通過一系列實驗，發現PFN1可能調控MLC的磷酸化，而磷酸化可以調節MV的分泌。
3.來自PFN1OE細胞的MVs促進了NSCLC細胞的遷移
Mv是癌癥轉移的關鍵介質。作者收集了轉移性（n=25）和非轉移性（n=20）肺癌患者的血清樣本，并提取了Mv（圖5）。作者通過一系列過表達，以及傷口愈合和Transwell遷移實驗，發現PFN1可能通過誘導MV分泌促進NSCLC轉移。
圖5. 為確定PFN1在腫瘤轉移中的作用而建立的轉移瘤小鼠模型示意圖
4.PFN1通過提高MV的分泌來促進體內NSCLC的轉移
為了進一步研究PFN1在NSCLC轉移中的作用，我們通過心內注射H1299NSCLC細胞建立了腫瘤轉移的小鼠模型，結果進一步證實了PFN1在NSCLC轉移中的作用（圖6）。
為了進一步研究PFN1在NSCLC轉移中的作用，我們通過心內注射H1299NSCLC細胞建立了腫瘤轉移的小鼠模型，結果進一步證實了PFN1在NSCLC轉移中的作用（圖6）。
圖6. HE染色小鼠模型肺組織的代表性圖像/肺組織中PFN1和p-MLC表達
5.PFN1促進MLC磷酸化的機制
作者通過敲低、過表達、co-IP、Western blot、免疫熒光、流式細胞術等實驗，發現PFN1可以與ROCK1相互作用，增強其激酶活性，并間接促進MLC磷酸化，最終誘導MV分泌。ROCK1抑制劑Y27632部分逆轉了PFN1促進MLC磷酸化和MV分泌的作用（圖7）。
作者通過敲低、過表達、co-IP、Western blot、免疫熒光、流式細胞術等實驗，發現PFN1可以與ROCK1相互作用，增強其激酶活性，并間接促進MLC磷酸化，最終誘導MV分泌。ROCK1抑制劑Y27632部分逆轉了PFN1促進MLC磷酸化和MV分泌的作用（圖7）。
圖7. western印跡法測定PFN1過度表達(A)/敲除(B)后的蛋白表達/PF
6.ROCK1抑制劑Y27632在體內和體外均部分逆轉了PFN1對NSCLC轉移的影響
創面愈合實驗顯示（圖8），Y27632處理的過表達PFN1的細胞遷移減少到接近EV細胞.接下來，將過表達PFN1的細胞來源的MVs添加到y27632處理的細胞中，發現Y27632并沒有逆轉過表達PFN1的細胞來源的MVs誘導的遷移，從Transwell遷移實驗中也得到了類似的結果，此外也用小鼠模型驗證了這些結果。
創面愈合實驗顯示（圖8），Y27632處理的過表達PFN1的細胞遷移減少到接近EV細胞.接下來，將過表達PFN1的細胞來源的MVs添加到y27632處理的細胞中，發現Y27632并沒有逆轉過表達PFN1的細胞來源的MVs誘導的遷移，從Transwell遷移實驗中也得到了類似的結果，此外也用小鼠模型驗證了這些結果。
圖8. 傷口愈合實驗評估Y27632的療效
03總結
研究結果表明，PFN1是關鍵的肌動蛋白調節蛋白，調控肌動蛋白細胞骨架的關鍵蛋白之一，它通過ROCK/p-MLC通路促進MV的釋放，從而促進NSCLC的轉移。因此，PFN1可能是NSCLC轉移的潛在治療靶點。通過減少MVs的釋放，有可能會部分逆轉PFN1過表達誘導的NSCLC細胞遷移。本研究為靶向轉移治療NSCLC提供了一種潛在的新方法，值得進一步研究。
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文/阿趣代謝組學
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蛋白組學
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