Abstract

新型病毒對人類健康構成了不容小覷的嚴重威脅，它們引起的感染往往會導致嚴重的疾病，甚至死亡，因為人類免疫系統尚無力對抗一種陌生的病毒，特別是人畜共患的病毒。最近的疫情也表明了新型病毒的危險性。假型病毒可用于輕松研究此類病毒的進入路徑。
 
 
簡介

由于種間傳播或病毒基因組的自然變化，新型病毒已具備對人類造成感染的能力，各種因素都會促進新型病毒的發生和傳播。在過去100年里，發生了多次新型病毒感染人類的情況，導致了局部出現疫情或全球傳播（大流行；見表1）。
 
 
對于新型病毒的研究目前一般局限于生物安全級別（BSL）達到 3 級或 4 級的高安全性實驗室（見表1）。BSL-4實驗室的工作非常費力且成本昂貴，而且僅可在少數幾個地點進行，因此很難在表征病毒病原體和開發抗病毒藥物方面取得快速的科學進展。

在這種情況下，假型病毒為安全有效地研究高致病性病毒進入細胞提供了一個有效的選擇。假型的常用系統基于彈狀病毒（例如，水泡性口炎病毒、VSV；圖1）和逆轉錄病毒。

本項研究的目的是驗證包膜蛋白介導的假型病毒進入是否反映了完整病毒的宿主細胞進入，以及確定所用試劑（在本例中為實驗室用水）的純度水平對假型病毒產生的影響。
  

圖1：假型VSV的制備： 1）VSV G反式互補VSV進入表達包膜蛋白的細胞。 2）中和過量病毒。 3）將待研究的包膜蛋白包埋在假型VSV的膜中，收獲假型VSV。

 
 
材料和方法

采用含 10 %胎牛血清和 1 %青霉素/鏈霉素溶液的DMEM培養基在 37 °C和 5 % CO2下培養HEK-293T、MDCKII和Vero E6細胞。傳代和接種時，細胞用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌，用胰蛋白酶/EDTA消化分離。

將VSV糖蛋白(VSV G)、埃博拉病毒糖蛋白(EBOV GP)、中東呼吸綜合征冠狀病毒S糖蛋白(MERS-CoV S) 、H1N1(1918)的甲型流感病毒的血凝素(HA)和神經氨酸酶(NA) 病毒包膜蛋白的質粒用作表達載體。

此外，使用二肽基肽酶4(DPP4)的表達質粒。空白表達質粒作為對照。使用鈣|磷酸鹽沉淀轉染HEK-293T細胞，其中所有緩沖液和溶液均使用去離子水或賽多利斯Arium® Pro VF超純水制備。
  
超純水的制備
使用Arium® Pro VF制備的超純水，水的TOC含量降至 2 ppb，電導率為 0.055 μS/cm(18.2MΩ×cm的電阻率)，補償至25°C。
 
假型VSV的制備
使用復制缺陷型VSV載體制備假型VSV，其中VSV糖蛋白（VSV G）的基因組信息被兩個報告基因替代，且 VSV G必須以反式提供。

用唾液酸酶或抑制劑預處理靶細胞
用 200 mU重組唾液酸酶處理MDCKII細胞，以從質膜的糖蛋白和糖脂中去除末端唾液酸。
 
分析包膜蛋白介導的宿主細胞進入
將靶細胞和假型VSV培養 1 小時，然后用PBS洗滌，并進一步用細胞培養基培養 16 – 20 小時。之后，使用螢光素酶裂解緩沖液裂解細胞，并且使用市售的測定試劑盒在化學發光儀中測量細胞裂解物中螢光素酶活性，以評估由包膜蛋白介導的轉導的效率。
 
 
結果
 
如果假型的包膜中嵌入了MERS-CoV S，則DPP4的定向表達使假型VSV進入宿主細胞顯著增加（見圖2A）。

唾液酸的去除導致假型VSV進入宿主細胞顯著減少，該假型VSV有H1N1(1918)HA/NA嵌入其包膜中（見圖2B）。這一發現證實假型病毒反映了真正的甲型流感病毒進入細胞的機制。
  圖2. 假型病毒受體依賴性進入細胞：
（A）將具有VSV G或MERS-CoV S的假型VSV用于接種之前已經用空載體（無受體）或人二肽基肽酶4(DPP4)的表達質粒轉染的HEK-293T細胞。（B）用具有VSV G或H1N1 (1918) HA/NA包膜蛋白的假型VSV接種經唾液酸酶預處理或未經處理的MDCKII細胞。轉導效率，即進入效率，由病毒編碼的螢光素酶的活性確定并標準化。此外，數據的統計顯著性通過t檢驗得到確認(*:p<0.05)。
 
埃博拉病毒糖蛋白在細胞進入過程中的激活具有pH依賴性并且需要半胱氨酸蛋白酶活性。在假型VSV背景下的EBOV GP介導的細胞進入還取決于酸性環境（見圖3A）和半胱氨酸蛋白酶的活性（見圖3B）。
  圖3：假型病毒pH依賴性進入細胞：
帶VSV G或EBOV GP的假型VSV用于接種預先用巴佛洛霉素A1(A)或E-64d(B)處理的Vero E6細胞（未處理的細胞用作對照）。通過病毒編碼的螢光素酶的活性確定假型病毒的轉導效率，即進入效率，并將所得數據標準化。此外，數據的統計學意義通過t檢驗得到確認(*:p<0.05)。

實驗室用水的水質影響假型VSV的質量：

在平行實驗中生成兩批假型VSV：一批使用中心實驗室供水源的去離子水（19 °C時電導率為 3.7 – 4.1 μS/cm）作為所有溶液和緩沖液的基本溶劑；另一批使用基于Arium® Pro VF超純水的溶液和緩沖液（電導率為0.055 μS/cm，補償至 25 °C）來制備。檢測了作為包膜蛋白的EBOV GP和MERS-CoV S。通過保持相同的孵育條件平行生產假型VSV，接種靶細胞，并量化包膜蛋白介導的假型VSV進入。

實驗表明，使用Arium® Pro VF超純水作為所有緩沖液和溶液的基本溶劑生產的假型VSV的宿主進入(作為質量程度的參數)顯著高于使用去離子水的假型的宿主進入(圖4)。
  圖4：實驗室用水的純度水平影響假型病毒的質量：
具有EBOV GP或MERS-CoVS的假型VSV用基于去離子水(顯示在“去離子水”狀態下)和Arium® Pro VF超純水(顯示在“超純水”狀態下)的緩沖液和溶液制備，并用于接種Vero E6細胞。通過定量病毒編碼的螢光素酶來確定假型病毒的轉導效率，即進入效率，并將所得數據標準化。此外，數據的統計學意義通過t檢驗得到確認(*:p<0.05)。
 
 
討論

本研究以復制缺陷型水皰性口炎病毒(VSV)為基礎產生假型病毒，并對各種高致病性病毒的包膜蛋白進行了研究。我們發現宿主細胞進入依賴于如真實病毒所描述的相同受體分子和生化過程。此外，我們還證明使用超純水生產假型VSV可以優化這一過程。

假型病毒是研究高致病性病毒進入宿主細胞的重要工具，不需要將這種高致病性病毒的研究限制于BLS-3或BLS-4實驗室。假型病毒的使用還降低了勞動強度、成本和其它諸多限制性因素，并顯著提高了操作的安全性。
 
 
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下載本篇《利用假型病毒對高致病性病毒進行研究》應用說明了解超純水質量在這種假型病毒制備中的重要性。