2022年7月8日, 锘海線上直播圍繞LS18平鋪光片顯微鏡技術、生物組織透明化技術、測樣服務平臺以及LS18平鋪光片顯微鏡應用案例等主題進行報告和展示。
 

在報告互動環節中，各位老師就目前課題方向提出諸多代表性疑問，讓我們一起回顧下精彩問答。
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Q: 什么是平鋪光片技術？以及該技術的控制的原理是怎樣的？

A：平鋪光片技術是一種新型的選擇性平面照明顯微鏡（SPIM）三維成像技術，在不增加光片厚度、不降低激發光片約束能力的情況下，增加SPIM的FOV。如圖1所示，在探測焦平面內沿光片長軸方向(y方向)平鋪小而薄的光片，在每個位置拍攝一幅圖像，將所有圖像組合并重建整個FOV的圖像。 

平鋪光片技術的控制原理：

在成像時，無論是通過移動物鏡或是移動樣本等物理方式，都會影響成像質量，造成artifacts。LS18光片顯微鏡創新地采用平鋪光片模式，通過對空間光調制器加載不同的相位圖以對激發光束進行調制，實現快速平鋪短而薄的光片，擴大了FOV且不影響空間分辨率和光學層析能力，從而獲得均一的高分辨率3D圖像。空間光調制器對激發光相位進行調制幾乎可以解決所有的光片校準問題，真正地實現顯微鏡儀器的自動校準，并且性能非常穩定，易于操作和維護。另外，根據不同樣品的研究需求，LS18光片顯微鏡能夠靈活地調整光片平鋪次數以及成像速度，實現不同類型的完整組織器官的3D結構與功能測量。

圖1. TLS-SPIM的工作原理，（左）通過快速平鋪小而薄的光片，（右）在每個位置拍攝一幅圖像，將所有圖像組合重建整個FOV的圖像，使得視野范圍內各處成像分辨率均一。

關于平鋪光片技術的詳細原理可參考以下文獻：

1. Gao, Liang. Extend the field of view of selective plan illumination microscopy by tiling the excitation light sheet[J]. Optics Express, 2015, 23(5):6102-11.

2. Fu Q , Martin B L , Matus D Q , et al. Imaging multicellular specimens with real-time optimized tiling light-sheet selective plane illumination microscopy[J]. Nature Communications, 2016, 7:11088.
 

Q: 用lectin標記血管時，是尾靜脈注射后再取器官然后透明化，還是先透明化再用染色儀器將lectin標記上?
A: 血管標記透明化和染色順序問題，在實驗案例當中，兩種方式我們都有嘗試過，實際上它都是可行的。首先，lectin的尾靜脈注射方式對整個灌注流程來說，需要非常大的技術把控性。如何做到良好的靜脈內注射并維持小鼠一定時間的存活率，對于實驗室新手可能需要多加練習。由于lectin具有半衰期，可參考發表文獻中的操作步驟，根據代謝動力學來選擇一個合適的時間，需要注意的是在灌注流程過程當中剝離取材時間或者說lectin的孵育時間。同時，有些客戶送到我們這邊的樣本可能在前期經過灌注后會產生熒光淬滅的問題，我們可以選擇性幫老師做鞏固結構及加強染色步驟。對于加強染色這部分，可用lifecanvas 的SmartBatch+主動式透明化/染色一體電泳儀，亦可采用傳統的被動滲透式方法來實現。
 

Q: 請問哪種透明方法和免疫染色結合的比較好?
A: 透明化方法和免疫染色的結合目前為止沒有好壞之分，大組織樣品免疫染色目前是世界性的難題，從目前眾多老師和我們測樣的經驗來看，油性染色方法中idisico和Pegasos的方法都比較可行，但是idisco涉及甲醇的脫水步驟，所以對抗體和甲醇的兼容性要求比較高，有條件的用戶我們建議可以先做個兼容性測試，這樣有助于提升后期染色的效率。

通常來說，熒光基團在水性的環境當中保存性也更好。所以，如果樣品可以滿足水性透明化方法的前提下，可以盡量嘗試采用水性透明化方法，同時關注指標染色特異性及有效性。

此外，大組織免疫染色還與樣品大小有關。在不同組織中，如：對于腸道、肺、整腦、整個腦連脊髓、心臟等各類樣品，方法和步驟都有區別。所以透明化方法一定要和免疫染色指標綜合考慮，才能尋找”更優解“，跟我們目前有限的經驗，需要根據樣品和染色指標來進行綜合篩選，尋找合適的組合。
 

Q: matrigel細胞外基質膠可以通過哪幾種透明化方法處理？
A：涉及matrigel細胞外基質的樣品一般多是類器官樣品，此類樣品可以通過多種方法透明進行透明化和染色。因為這類樣品相對whole tissue來說一般體積較小，所以這個情況下，實際上有多種透明化方法可嘗試，甚至可以結合我們更新的膨脹技術達到納米級別的分辨，在3D納米級水平完整展示整個類器官樣品形貌。為方便廣大科研老師，我們锘海依托大量實驗案例開發出的組織透明化試劑盒（#NH-210701）就可以應用于類器官的透明化，試劑盒附有詳細實驗步驟可供老師選擇。
 

Q: 采集的圖像信息量很大，如何進行數據處理？大量的光學切片需要拼接，軟件怎么選擇？另外，用什么軟件實現細胞分割和單細胞追蹤？定量分析可以采用第三方軟件嗎？圖像輸出是什么格式？

A：平鋪光片顯微鏡采集的大樣本成像數據量能達到幾百GB或TB級別，可通過锘海自主研發的數據預處理軟件對采集圖像預處理，輸出.3dtiff格式的原始數據供第三方數據分析軟件調用（如圖2所示）。通過第三方軟件或自主拼接軟件即可實現將所有ROI數據都拼接在一起，得到一個完整樣品的3D數據（如下圖所示）。

圖2. 平鋪光片經數據提取后得到全視野高分辨率的圖像

目前能實現3D大圖拼接的第三方軟件有很多，如Amira、Imaris，均可以對.3dtiff格式原始數據進行處理，可實現常規的單個區域數據結果快速查看、單個區域數據動態展示、大樣本數據整體拼接、大樣本組織整體圖像處理及展示等操作。另外，3D成像的數據處理對電腦性能配置也有一定的需求，一般推薦128GB以上內存，4T以上的SSD，并需配備較高性能獨立顯卡。

上述這些第三方的專業圖像處理軟件均有相應的圖像分析模塊，可實現分割、單細胞追蹤及定量分析等功能。
 

Q: 組織透明化對組織本身有化學損傷嗎？會破壞組織內熒光物質（如GFP）嗎？

A: 組織透明化方法分為主動式透明化方法和被動式透明化方法兩個大類，以引入外力或生化試劑的被動擴散來完成對組織的透明化，組織透明化技術保留了組織的細胞間連接和細微特征。不同的組織透明化方法因其機理不同，對組織的形態、透明程度、透明效率、脂質留存、內源性熒光信號、核酸物質、免疫染色等的影響不盡相同。例如被動式透明化方法中的有機溶劑透明化方法，通過先脫去組織的水分，再利用高折射率的有機溶液進行折射率匹配，雖然達到很好的透明效果，但是對于熒光蛋白的信號產生淬滅作用。熒光蛋白中的親水基團使得親水溶劑透明化方法更有利于熒光的保存。被動式的親水溶劑透明化方法通過浸泡將低折射率的組織液、細胞液或是高折射率的脂質逐漸替換，實現折射率一致，這類方法雖然更利于熒光保存，但耗時較長。基于CLARITY/SHIELD技術的主動式透明化方法從保護熒光蛋白構象出發，不僅能留存內源性蛋白、核酸，還通過電泳加速移除脂質，使透明化的效率提高。

 

參考文獻：

馮異. 醫學組織透明化三維成像 [M]. 復旦大學出版社，2020：3-21.

Chung et al., Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature, 2013.

Park et al., Protection of tissue physicochemical properties using polyfunctional crosslinkers. Nature Biotechnology, 2019. 
直播回放視頻鏈接：https://v.qq.com/x/page/g3347h98jn8.html?sf=uri

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