利用紫外法測(cè)定鮭魚精DNA熔解溫度（Tm）

瀏覽次數(shù)：1566　發(fā)布日期：2022-7-11　來(lái)源：本站　僅供參考，謝絕轉(zhuǎn)載，否則責(zé)任自負(fù)

蟬鳴聲聲入夏來(lái)，烈日高照，暑氣炎炎，歡迎來(lái)到一年一度的人間大火爐時(shí)節(jié)——夏季。夏天，我們享受著天然免費(fèi)的汗蒸和干蒸，不僅大腦熱到顫抖，連DNA都要化了，離變異也不遠(yuǎn)了。

冇使驚，冰凍西瓜、冰可樂(lè)、雪糕刺客、空調(diào)……解暑降溫神器紛紛登場(chǎng)，救我一命。勇敢的朋友還可以剃個(gè)光頭過(guò)個(gè)清涼的夏天。

綜上可見，生物對(duì)溫度的變化是很敏感的，溫度的變化影響著世間萬(wàn)物。從古至今，對(duì)于溫度的控制和熱量的利用，也在人類生活生產(chǎn)中扮演了至關(guān)重要的角色。在生命科學(xué)研究領(lǐng)域，溫度是實(shí)驗(yàn)中非常重要的一個(gè)參數(shù)。例如，使用紫外法測(cè)定DNA熔解溫度（Tm）就是一項(xiàng)非常經(jīng)典的需要樣品控溫的實(shí)驗(yàn)。

DNA 的變性的特點(diǎn)是爆發(fā)式的, 變性作用發(fā)生在一個(gè)很窄的范圍。通常把DNA 的雙螺旋結(jié)構(gòu)失去一半時(shí)的溫度稱為該DNA 的熔點(diǎn)或熔解溫度( melting temperature ) , 用Tm 表示。DNA 的Tm 值一般在70～85 ℃之間。DNA的變性從開始解鏈到完全解鏈，是在一個(gè)相當(dāng)小的溫度范圍內(nèi)完成的，一系列物化性質(zhì)也發(fā)生改變: 260 nm 區(qū)紫外吸收值增高(增色效應(yīng)) , 粘度降低, 浮力密度降低等。所以，我們可以利用紫外可見分光光度計(jì)檢測(cè)DNA樣品在260nm處吸光度隨溫度的變化，對(duì)解鏈過(guò)程進(jìn)行監(jiān)測(cè)。

不同種類DNA的Tm值不同：G-C 的含量越高, Tm 越高（由于鳥嘌呤-胞嘧啶（G≡C）核苷酸之間有3個(gè)氫鍵，而腺嘌呤-胸腺嘧啶（A=T）之間有2個(gè)氫鍵，G≡C核苷酸解離所需能量大于A=T堿基對(duì)所需能量。）, 由Tm 值可推算出GC含量。其經(jīng)驗(yàn)公式為: ( G-C)% = ( Tm - 69.3 ) ×2.44

在以下示例實(shí)驗(yàn)中，使用梅特勒-托利多紫外可見分光光度計(jì)UV7配備酷T（CuveT）恒溫器，測(cè)定20℃-95℃升溫范圍內(nèi)鮭魚精DNA在260nm處的吸光度變化，以監(jiān)測(cè)其變性過(guò)程。我們用各溫度點(diǎn)測(cè)得的吸光度繪制圖譜，可得到一條溫度-吸光度S形曲線，如下圖所示：

圖：260nm處鮭魚精DNA的熔解曲線（案例來(lái)源梅特勒公眾號(hào)）

在此實(shí)驗(yàn)案例中，鮭魚精DNA的Tm值通過(guò)確定S形曲線的拐點(diǎn)來(lái)確定。經(jīng)測(cè)定和計(jì)算，鮭魚精DNA的Tm值為64.4℃，說(shuō)明其G≡C堿基對(duì)的濃度相對(duì)較低。確定熔解溫度的另外一種方法是用切線法對(duì)S形曲線的拐點(diǎn)進(jìn)行圖形化評(píng)估。

我司已為廣大相信光的實(shí)驗(yàn)奧特曼準(zhǔn)備好了應(yīng)用秘笈和成套裝備，輕松應(yīng)對(duì)需要對(duì)樣品進(jìn)行溫控的紫外實(shí)驗(yàn)。梅特勒-托利多超越系列紫外可見分光光度計(jì)可搭載酷T帕爾貼控溫系統(tǒng)或勞達(dá)（LAUDA）等水浴恒溫系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品精準(zhǔn)快速的溫度控制：

梅特勒-托利多紫外可見分光光度計(jì)+酷T帕爾貼控溫系統(tǒng)方案：

梅特勒-托利多紫外可見分光光度計(jì)+勞達(dá)（LAUDA）水浴溫控系統(tǒng)聯(lián)用方案：

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