骨骼肌萎縮是多種疾病的臨床癥狀之一，其特點是肌肉質量和收縮功能的喪失，這會導致患者的生活質量下降以及死亡率的上升。因此，了解萎縮性肌肉的細胞轉錄組特征對于探索肌萎縮的分子機制和制定相應的治療策略至關重要。本文中，研究者利用單細胞核轉錄組測序技術描繪了失神經肌肉纖維的轉錄異質性，確定了肌肉組織中細胞群體獨特的萎縮反應基因特征，并揭示了失神經肌肉纖維和其他駐留細胞中未描述的多樣性，為治療失神經或其他相關分解代謝因素引起的肌肉萎縮提供了潛在的細胞和分子靶點。

文章詳情

文章題目：Decoding the transcriptome of denervated muscle at single-nucleus resolution

中文題目：單細胞核轉錄組測序解析失神經肌肉的轉錄組

發表時間：2022.06

期刊名稱：J Cachexia Sarcopenia Muscle

影響因子：12.190

實驗平臺：10x Chromium單細胞核轉錄組測序、IHC

DOI：10.1002/jcsm.13023

 

研究思路

研究內容

• 正常和失神經肌肉的異質性和細胞類型組成

為了研究萎縮和肌肉細胞異質性之間的關系，研究者構建小鼠坐骨失神經模型（導致I型和II型肌纖維嚴重萎縮），并收集腓腸肌樣品進行10x 單細胞核轉錄組測序，共獲得29539個細胞核轉錄組數據（正常3只，模型3只），聚類后得到30個clusters，注釋成12種已知細胞類型。在正常組織中，II型肌核比例最高。失神經后，I和II型肌核、內皮細胞和周細胞比例降低，纖維成脂祖細胞（FAP）、巨噬細胞和未分類細胞核比例上升。其中，未分類細胞核表達多種細胞類型的特征基因，可能是多個細胞譜系的混合群體。擬時序分析則在肌核、FAP和內皮細胞發現細胞動態軌跡，失神經延長了肌核的軌跡，而FAP和其他駐留細胞軌跡受到影響較小，表明失神經導致肌纖維的轉錄和異質性變化更為明顯。

Fig.1 正常和失神經腓腸肌的核/細胞類型分類

• II型肌核異質性對失神經的反應

擬時序分析進一步探究發現正常組織中，II型肌核呈從IIa延伸到IIx的連續軌跡，接下來是IIb1和IIb2。而在模型組中這一軌跡發生顯著變化，且IIb2型肌核比例的顯著增加，意味著在II型肌纖維中，失神經促進了肌核向特化IIb2型核的轉變。差異比較分析和IHC染色揭示IIb1和IIb2型肌核存在于同一肌纖維中。失神經后，IIb2型核中幾個肌萎縮相關基因，鈣信號、MAPK和HIPPO通路在失神經的IIb2肌核中富集，GSEA表明涉及氧化磷酸化和缺氧的標志性基因集在正常IIb1肌核中豐富，而在失神經IIb2肌核中下調。相反，帶有涉及TGF-β和MYC信號的基因的標志集在失神經IIb2型肌核中顯著豐富。SCENIC分析在II型肌纖維中鑒定到147個活躍調節子，且所有肌核可以被劃分為預期的亞型，這與使用軌跡分析獲得的聚類結果一致。這些結果表明，在II型肌核中，失神經激活了獨特的基因調控網絡，驅動了纖維類型特異性轉錄變化。

Fig.2 軌跡顯示了II型肌核轉錄的異質性

Fig.3 正常和失神經狀態下IIb2型肌核的基因調控網絡

失神經的I型肌核的轉錄和異質性改變

I型肌核軌跡分析發現其沒有節點和分支，說明異質性低。受失神經影響的I型核形成了與正常組不同的cluster，反映了失神經對轉錄組的顯著改變。Kegg分析表明失神經的I型肌核差異表達基因（DEG）與蛋白質降解、自噬、AMPK、mTOR和胰島素信號轉導等被證明與肌肉萎縮有重要關系的途徑有關。GSEA揭示I型肌核中脂肪酸代謝、氧化磷酸化等通路在正常組織中豐富但在失神經組織中下調。SCENIC分析發現在正常I型纖維中優勢基因調控網路中的調控子在失神經中下調，而CEBP-β，δ，γ和ζ調節子被顯著激活，這與先前報道的C/EBPβ促進肌肉萎縮相關基因在癌癥惡病質中的表達一致。

Fig.4 I型肌核對失神經的轉錄反應

• 失神經后肌核的代謝可塑性和異質性

為了探究肌纖維的代謝異質性和對失神經的適應性反應，研究者使用Single-Cell-Meta-bolic-Landscape分析單細胞核轉錄組數據，構建了在I/II型肌核中檢測到的1401個代謝基因的UMAP圖譜，表明代謝特征對纖維類型的表型變化有很大影響。在正常肌肉中，代謝活性從氧化性I型肌核到糖酵解IIb型肌核呈逐漸下降趨勢，失神經后，所有肌核都的代謝活動顯著下調，說明失神經導致肌纖維代謝需求減少，即失神經可以誘導肌肉進行實質性的新陳代謝適應。代謝基因表達下降在氧化肌核(I/IIa型)最大，糖酵解(IIb1/2)肌核最小，暗示氧化肌纖維的代謝狀態可能更容易受失神經影響。

Fig.5 正常和失神經肌肉的肌核代謝圖譜

• 失神經FAP的異質性和表型

對FAP進行軌跡分析，發現失神經后，從主軌跡中形成了三個分支，暗示了FAP的轉錄變化。分析FAP三個亞群的正常和失神經細胞基因的表達差異，發現在正常FAP中，富集了與肌肉發生、缺氧和代謝相關的特征，但都在失神經FAP中下調。此外，作為對失神經的反應，這些亞群富集了不同的基因集。失神經激活C2和C3 FAP以使其分別獲得促纖維化和促脂肪生成的特征。在正常和失神經FAP中發現了297個活性調節子，失神經導致正常FAP中最活躍的調節子被抑制，伴隨著其他調節子的適應性激活，特別在C3中有超過120個調節子被強烈激活，其中一些特定的調節子可能驅動FAP的表型變化。此外，研究者還發現C2 顯示出更高的STAT3調節蛋白活性，據報道可在失神經期間促進肌纖維萎縮和纖維化，并且還發現了幾個新的調節子在失神經后FAP中活性顯著增加，其作用有待進一步研究。

Fig.6 FAPs對失神經的轉錄反應

• 失神經肌肉中巨噬細胞的表達改變

在正常和失神經肌肉中，巨噬細胞（MPs）是主要的炎性細胞，分為2個亞型：骨骼肌駐留和單核細胞來源MPs。在失神經肌肉中，巨噬細胞總數增加且駐留型MPs的比例明顯升高。軌跡分析表明駐留型MPs產生了一個連續的軌跡，兩個clusters對應正常和失神經的駐留MPs。差異分析、富集分析和GSEA表明失神經駐留MPs中與纖維化或免疫反應相關的基因上調表達，涉及免疫反應、趨化因子受體結合的基因集顯著豐富。SCENIC分析結果說明失神經可能會增強肌肉駐留MPs的自我更新能力。

Fig.7 巨噬細胞對失神經的轉錄反應

• 肌纖維與其他駐留細胞之間的通訊對失神經的反應

為了探究失神經肌肉中細胞間互作關系，研究者利用配體受體互作分析在正常和失神經肌肉中分別推斷出592和48個配體受體對，表明失神經對細胞通訊有明顯的抑制作用。因為失神經誘導的分解代謝信號是在肌纖維中啟動的，所以優先考慮從肌纖維到駐留細胞的互作信號。正常I型肌纖維表達較高的Fgf1、Mapt、Angpt1等配體，而II型肌纖維表達較高的Vefga、Fgf13、Cadm1。失神經配體受體相互作用顯著下降，反映失神經減少了肌纖維對駐留細胞的影響。由于肌纖維分泌的Fgf1被認為是維持MuSCs功能的關鍵，結果表明，肌纖維中Fgf1的下調可能是導致MuSCs在失神經過程中功能障礙的機制之一。然而，研究者也在失神經的MuSCs中檢測到MAPK通路的激活：KEGG分析顯示失神經的MuSCs富集MAPK信號通路，而SCENIC分析捕捉到作為MAPK通路靶向轉錄因子之一的Ets1調節子的激活。這些結果表明，其他的FGF家族成員可能參與了MuSCs中MAPK信號的激活反映了肌肉失神經過程中MAPK信號的復雜調控。

使用相同的策略研究從駐留細胞到肌纖維的通信，發現在正常肌肉中有85對相互作用，在失神經肌肉中有25對相互作用，表明失神經也減少了從駐留細胞到肌纖維之間的通訊。在正常組織中預測到從巨噬細胞到I型肌纖維的互作，包括Itga4、Fn1、Ptprc和Tfrc間的互作，但是這些互作關系對被失神經抑制。由于Tfrc已被證明對肌肉發育和新陳代謝至關重要，結果表明巨噬細胞可能在維持正常肌肉內穩態方面發揮關鍵作用。失神經刺激巨噬細胞中某些配體的表達，這可能對肌纖維產生異常影響。FAPs是最大的駐留細胞群，依賴于環境的變化，它們能夠分泌促肌生成因子和促萎縮因子，研究者鑒定到FAPs到II型肌纖維在正常組織中的交互作用，它們在失神經影響下互作強度降低。綜上所述，失神經抑制了肌肉細胞間的整體通訊，同時也刺激了駐留細胞中促萎縮因子的表達，這可能導致失神經誘導的肌肉萎縮。

Fig.8 失神經后肌纖維與其他駐留細胞之間的配體-受體相互作用

主要結論

本研究利用肌肉萎縮的坐骨失神經小鼠模型，使用單細胞核轉錄組技術從正常和失神經小鼠中生成腓腸肌的單核轉錄圖譜，共獲得29539個肌肉細胞核，被分為13個類型。其中，IIb型肌核進一步分為兩個亞群，命名為IIb1型和IIb2型肌核。失神經損傷后，IIb2型肌核比例顯著增加。軌跡分析顯示，失神經IIb2肌核明顯偏離正常IIb2肌核，表明該亞群在失神經后經歷了強烈的轉錄重編程。肌核的代謝圖譜顯示，大多數代謝途徑被失神經影響而下調，而一些代謝信號，如谷胱甘肽代謝，在失神經的IIb2型肌核中被特異性激活。研究者還探究了I型肌纖維、肌肉干細胞、纖維脂肪祖細胞、巨噬細胞、內皮細胞和周細胞的轉錄變化，并表征了它們對失神經的特征反應。通過預測細胞間的相互作用，觀察到肌纖維和肌肉駐留細胞之間的通訊因失神經而減少。綜上所述，這些結果定義了與失神經誘導的肌肉萎縮相關的肌核轉變、代謝重塑和基因調控網絡重編程，并闡明了肌肉細胞對分解代謝反應的異質性和可塑性的分子基礎，為探索肌肉萎縮的分子機制奠定基礎。

參考文獻：

Lin, Hongchun et al.“Decoding the transcriptome of denervated muscle at single-nucleus resolution.”Journal of cachexia, sarcopenia and muscle, 10.1002/jcsm.13023. 20 Jun. 2022