體外培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞已廣泛應(yīng)用于血管疾病、血管修復(fù)、腫瘤血管形成等基礎(chǔ)研究及臨床研究中。體外培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞，仍可保持血管內(nèi)皮細(xì)胞的特征，如表達(dá)VIII因子、懷布爾－帕拉德小體(Weibel-Palade body ) 、內(nèi)皮細(xì)胞特異性抗原和IV 型膠原等，還可在三維培養(yǎng)體系或特定誘導(dǎo)條件下形成血管樣結(jié)構(gòu)。體外培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞生長形成單層后，會(huì)表現(xiàn)出接觸抑制和密度限制，將停止生長。人們已成功培養(yǎng)了牛主動(dòng)脈內(nèi)皮、人臍靜脈內(nèi)皮、腦微血管、肺微血管、肝竇微血管及各種腫瘤組織中的血管內(nèi)皮細(xì)胞。下面小海星就來介紹下最常用的人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)。
 

1. 設(shè)備  超凈工作臺(tái)、離心機(jī)、水浴鍋、CO2培養(yǎng)箱、－10℃ 冰箱、－20℃冰箱。

2. 無菌材料  大培養(yǎng)皿、止血鉗、靜脈插管、500ml 大燒杯、消毒的蒸餾水、50ml 離心管、刻度吸管、彎頭吸管、T25 培養(yǎng)瓶、廣口試劑瓶、臍帶(1根）、保鮮液(0.01% EDTA/DMEM, 4℃儲(chǔ)藏）、高糖DMEM 培養(yǎng)液、胎牛血清、青／鏈霉素、D-Hanks 溶液、I 型膠原酶、VEGF 或ECGS 。
 

二、操作流程

1. 產(chǎn)科無菌取臍帶1 根， 置于含保鮮液的廣口試劑瓶中4℃保存（避免污染），在最短的時(shí)間內(nèi)，將臍帶攜入實(shí)驗(yàn)室，進(jìn)行以下操作。

2. 在超凈工作臺(tái)或無菌層流工作臺(tái)上，將臍帶用D-Hank 溶液清洗干凈，將靜脈插管插入臍靜脈中，并用絲線結(jié)扎、固定。

3. 用20ml 注射器將37℃ 的D-Hanks 溶液注入臍靜脈，反復(fù)沖洗至清洗液無色澄清為止。

4. 用血管鉗夾住臍靜脈的另一端，并將0.2％的Ⅰ型或Ⅱ 型膠原酶（約20ml) 通過靜脈插管注入臍靜脈中， 至臍靜脈完全充盈為止（排掉靜脈管中的空氣）。

5. 將臍帶放置在盛有37℃水的玻璃燒杯中，在37°C 水浴條件下消化約20min（每5min 抽吸／注入1 次）。

6. 當(dāng)酶液變成混濁時(shí)（在顯微鏡下可見大量游離細(xì)胞），將酶液在臍靜脈中反復(fù)抽吸沖打3 次后，吸出并置于50ml 離心管中。

7. 細(xì)胞懸液經(jīng)350g 離心5min 后，棄去上清液，并用D-Hanks 溶液清洗2次，然后再以350g 離心5min 。

8. 棄去上清液，將細(xì)胞溶于8ml 內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液(M l99 80ml、FBS 20ml 、PS 1ml 、L-Gln 2mM、ECGS 10mg/100ml 、Heparan 4000U/1 00ml 、Insulin mu/100ml)中，接種于預(yù)先包被2％明膠的T25 培養(yǎng)瓶中。

9. 細(xì)胞培養(yǎng)在37℃ 、5% CO2培養(yǎng)箱中， 24h 后換液，棄掉未貼壁細(xì)胞。之后每2~3d 換液1 次， 待細(xì)胞匯合時(shí)消化傳代。
 

體外培養(yǎng)成功的細(xì)胞，需進(jìn)行純度鑒定。可提供檢測其特性來鑒定，如表達(dá)Ⅷ 因子、Weibel-Palade 小體，攝取乙酰化低密度脂蛋白，表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞特異性抗原CD31 等。
 

四、提 示

培養(yǎng)的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞是使用最規(guī)范的體外血管內(nèi)皮細(xì)胞模型。其培養(yǎng)已較成熟。但由于其傳代有限，往往需不斷重復(fù)培養(yǎng)。另外，培養(yǎng)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞時(shí)，最好能添加VEGF 或ECGS, 以刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，可增加傳代數(shù)，獲得較多的血管內(nèi)皮細(xì)胞用于研究。
 

五、培養(yǎng)注意要點(diǎn)

1. 永生化的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）培養(yǎng)注意要點(diǎn)：

（1）該細(xì)胞為有限傳代細(xì)胞系，在體外培養(yǎng)可傳20代。請注意代次控制;

（2）該細(xì)胞培養(yǎng)難度較高，建議使用專用培養(yǎng)基。

2. 永生化的人臍靜脈內(nèi)皮培養(yǎng)體系：內(nèi)皮細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基＋5% FBS＋1%內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)添加劑+1% P/S。

推薦使用海星人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞完全培養(yǎng)基，貨號(hào)：TCH-G406。

3. 如選擇使用其它品牌培養(yǎng)基，可選：

（1）內(nèi)皮細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基推薦：ScienCell（Cat.No.1001）

基本成分介紹：永生化的人臍靜脈內(nèi)皮培養(yǎng)體系是專門為血管內(nèi)皮細(xì)胞體外培養(yǎng)設(shè)計(jì)的最適于其生長的完全培養(yǎng)基。包含必需和非必需氨基酸、維生素、有機(jī)和無機(jī)化合物、激素、生長因子、微量礦物質(zhì)和低濃度胎牛血清(5%)。該培養(yǎng)基的配方能夠選擇性的促進(jìn)正常血管內(nèi)皮細(xì)胞體外培養(yǎng)中的增殖和生長，并為其達(dá)到最理想營養(yǎng)平衡狀態(tài)。

（2）胎牛血清推薦：HyCyte™干細(xì)胞預(yù)篩選胎牛血清 （Cat.No.FBP-S001）

基本成分介紹：適用于有較高要求的細(xì)胞和較難獲得的細(xì)胞，如血管內(nèi)皮細(xì)胞。

（3）內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)添加劑推薦：ScienCell（Cat.No.SC1052)

基本成分介紹：內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)添加劑(ECGS)是一種從牛腦垂體提取的培養(yǎng)基補(bǔ)充劑，含有培養(yǎng)血管內(nèi)皮細(xì)胞所必需的生長因子、激素和蛋白質(zhì)。該補(bǔ)充劑最大限度地促進(jìn)永生化的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）的生長，該因子的添加對維持永生化的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）形態(tài)至關(guān)重要。

注意：

請務(wù)必使用以上兩種推薦培養(yǎng)體系進(jìn)行永生化的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）的培養(yǎng)，否則可能導(dǎo)致細(xì)胞無法增殖。

T25瓶細(xì)胞由于運(yùn)輸過程影響細(xì)胞會(huì)分泌產(chǎn)生的少量小黑點(diǎn)，不是污染問題，屬正常現(xiàn)象，使用專用培養(yǎng)體系進(jìn)行培養(yǎng)后黑點(diǎn)會(huì)逐步減少。

永生化的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）對血清的品質(zhì)要求較高，請使用高品質(zhì)胎牛血清進(jìn)行培養(yǎng)。如細(xì)胞狀態(tài)欠佳，建議將胎牛血清的濃度提高到10%。