柯薩奇病毒和腺病毒受體介導內皮細胞對流體剪切應力的反應
柯薩奇病毒和腺病毒受體（CAR）是 B 組柯薩奇病毒和 C 亞組腺病毒的病毒受體，普通存在于心肌細胞表面。心肌中 CAR 表達增加與心肌病相關。在 ECs 中，炎性細胞因子，如腫瘤壞死因子α（TNF-α）和干擾素γ（IFN-γ），下調 CAR 表達和 CAR 介導的中性粒細胞的跨內皮遷移。盡管對 CAR 作為病毒受體的功能已有相當多的了解，但在剪切應力下 CAR 在 ECs 中的表達模式和生理作用仍不清楚。
因此，韓國梨花女子大學醫學研究所、生命科學系、中原大學生物醫學工程系的課題組的一項研究展示了 CAR 在 FSS 條件下在血管內皮細胞（ECs）中的表達、調控機制和作用。文章名為《Coxsackievirus and adenovirus receptor mediates the responses of endothelial cells to fluid shear stress》。
實驗使用單向穩定流（20 dyne/cm2 的剪切應力）用于 LSS 和雙向擾動流（±5 dyne/cm2的剪切應力）用于振蕩剪切應力（OSS）。在 LSS 和 OSS 之間的交叉實驗中，HUVECs 暴露于 LSS 或 OSS 24 小時，然后暴露于其他類型的剪切應力 24 小時。
FSS 調節 ECs 中的 CAR 表達
首先通過測量受到 LSS 或擾動流的 HUVECs 中CAR 表達來研究 FSS 是否調節內皮細胞 CAR 的表達。有趣的是，干擾流上調，而 LSS 下調，CAR 在 mRNA和蛋白質水平上的表達。通過蛋白質印跡檢測 CAR 蛋白顯示兩條條帶，一條為約 40 kDa，一條為 46 kDa。實驗發現 FSS 模式的變化主要調節 CAR 的表達，由 40 kDa 的條帶表示。
為了研究 FSS 對體內內皮 CAR 表達的影響，通過en face 染色評估了自然暴露于各種血流模式的小鼠主動脈組織中的 CAR 的表達。CAR 在擾流的小彎側（LC）區域的表達高于暴露于 LSS 的胸主動脈（TA）區域。如 z-stack 表面成像所示，擾流區域中的 CAR 表達主要位于內皮的管腔表面。
接下來研究了人體動脈組織中的內皮 CAR 表達。與小鼠主動脈組織一致，暴露于干擾流的區域比暴露于正常層流的區域顯示出更高水平的 CAR 表達。
ECs中的CAR表達受流量敏感的KLF2/AP-1軸調節
KLF2 是一種血流響應性關鍵剪切應力誘導的轉錄因子，控制許多流量調節的內皮基因的表達。剪切應力處理后，CAR表達與KLF2表達呈負相關。因此假設，KLF2 調節 ECs 中的 CAR 表達。為了驗證這一假設，評估了轉染 KLF2 或編碼 KLF2 的質粒的 siRNA 的 HUVECs 中的 CAR 表達。
正如預期的那樣，在 LSS 下減少的 CAR 表達在 KLF2 沉默時增加。相反，當 KLF2 過表達時，OSS 下增加的 CAR 表達減少。此外，KLF2 通過抑制 AP-1和核因子kappa B（NF-κB）的激活來下調促炎基因的表達。
為了研究流動條件下 AP-1 是否與 CAR 表達相關，用 AP-1 抑制劑 SR11302 預處理后將 HUVECs 暴露于剪切應力。AP-1抑制降低了OSS中的CAR上調。與這一發現一致，當 AP-1 復合物的成分 c-Jun 和 c-Fos 被沉默時，OSS 下增加的 CAR 表達降低。
接下來檢查了 KLF2 對 CAR 的抑制是否由 AP-1 激活阻斷介導。為了檢測 KLF2 對 AP-1 激活的影響，評估了 KLF2 過表達或敲低后 HUVECs 中 c-Jun 和 c-Fos 的表達。KLF2過表達消除了OSS誘導的c-Jun和c-Fos mRNA水平的增加，而LSS條件下的KLF2敲低細胞顯示出c-Jun和c-Fos的mRNA水平高于LSS 條件下的細胞。與 LSS 下相比，OSS 始終增強 AP-1 啟動子活性。然而，KLF2過表達抑制了OSS誘導的AP-1啟動子活性增加。因此，CAR 在 ECs 中的表達受流量響應性 KLF2/AP-1 軸的調節。
CAR敲低抑制ECs中擾流誘導的炎癥反應
擾流通過激活 NF-κB 通路誘導內皮炎癥。NF-κB 的激活是由抑制亞基 IκB 的磷酸化和 NF-κB p65 的核轉位介導的。為了探索 CAR 在 ECs 中的作用，確定了 CAR 對擾動流誘導的 NF-κB 活化的影響。IκB 的磷酸化和 NF-κB p65 的核轉位在 OSS 中增加，但這種增加被 CAR 敲低抑制。
接下來探討了 CAR 對 NF-κB 下游信號傳導的影響：抗炎 eNOS 基因和促炎基因的表達，例如CAR 敲低的 HUVECs 中血管細胞粘附分子1（VCAM-1）和細胞間粘附分子1（ICAM-1）。eNOS 在 mRNA 處和蛋白質水平上顯著下調，而與LSS相比，在OSS下VCAM-1和ICAM-1上調。有趣的是，通過 CAR 敲低，OSS 介導的 eNOS 表達減少升高，而 OSS 下 VCAM-1 和 ICAM-1 水平的增加被 CAR 敲低抑制。
為了評估 CAR 敲低介導的 OSS 誘導的粘附分子水平降低的功能相關性，評估了單核細胞對 HUVECs 的粘附。CAR敲低抑制了OSS誘導的單核細胞對ECs的粘附增加。
CAR缺失對擾流下的致動脈粥樣硬化內皮具有保護作用
接下來，通過在 C57BL6 背景上生成 EC 特異性 CAR KO 小鼠并利用部分頸動脈結扎作為干擾流誘導的動脈粥樣硬化模型，來確定CAR缺失對體內內皮細胞的影響。在部分頸動脈結扎 3 天后，評估了野生型（WT）和 EC 特異性 CAR KO 小鼠中抗炎基因和促炎基因的表達。從頸動脈內皮中分離出總 RNA，經RT-PCR檢測，證實存在內皮特異性標志物（PECAM-1），而不存在平滑肌細胞特異性標志物（α-SMA）。RT-PCR 證實了 ECs 中的有效 CAR KO。
在WT小鼠中，與具有正常層流的未結扎的右頸動脈（RCA）相比，結扎的左頸動脈（LCA）中的CAR表達上調，這與體外實驗的結果一致。同樣，通過實時 PCR 和免疫組織化學評估，在結扎的 LCA 中，抗炎標志物 eNOS 的水平顯著降低，而促炎標志物 VCAM-1 和 ICAM-1 的水平升高。然而，在干擾流下 EC 特異性 CAR KO 小鼠中，沒有觀察到 VCAM-1 和 ICAM-1 水平的增加。eNOS 表達的減少比在具有結扎 LCA 的 WT 小鼠中觀察到的要少。
在部分頸動脈結扎和食用西方飲食后 4 周，WT 小鼠的頸動脈粥樣硬化的替代標志物—內膜中層厚度（IMT）增加。相比之下，EC 特異性 CAR KO 小鼠的 IMT 降低（圖4 d）。此外，比較了人體動脈組織正常和動脈粥樣硬化區域的內皮 CAR 表達。正如預期的那樣，動脈粥樣硬化斑塊區域的CAR表達水平高于正常動脈區域。
總之，結果表明，CAR 缺失通過阻斷暴露于干擾血流的 ECs 中的炎癥反應發揮抗動脈粥樣硬化作用，并且 CAR 在頸動脈結扎后觀察到的 IMT 增加中起重要作用。
CAR通過調節PECAM-1磷酸化調節FSS誘導的內皮機械轉導
為了探索 CAR 在 ECs 對剪切應力響應中的機械轉導信號傳導功能，評估了 Src、PI3K、Akt 和 eNOS 在轉染 siCAR 或質粒編碼 CAR 的 HUVECs 中的磷酸化。LSS 誘導 Src（pY416，活性形式）、PI3K、Akt 和 eNOS 的激活，而 OSS 不激活這些分子。在 Src 磷酸化方面，與 LSS 相比，OSS 中 Src 的 Y527 抑制形式增加。CAR 敲低逆轉了 OSS 中 Src（Y416）、PI3K、Akt 和 eNOS 的磷酸化降低，而 Src（Y527）的磷酸化受到抑制。相反，CAR過表達消除了Src（Y416）、PI3K、Akt和eNOS的激活以及LSS誘導的Src磷酸化（Y527）的降低。
為了確定 CAR 對 PECAM-1 磷酸化的影響，評估了 PECAM-1 免疫沉淀物中的酪氨酸磷酸化。通過CAR敲低恢復了OSS下PECAM-1的磷酸化降低，而CAR過表達消除了LSS下增強的PECAM-1磷酸化。使用共聚焦顯微鏡，發現 CAR 與 PECAM-1 共定位。因此，通過基于免疫染色的原位鄰近連接測定（PLA）研究了 CAR 與暴露于擾動流的 HUVECs 中機械感覺復合物之間的內源性蛋白質-蛋白質相互作用。PLA揭示了在OSS下表達增加的CAR與HUVECs中的機械感覺復合物物理相關性。
總之，這些發現表明CAR與ECs中的PECAM-1和其他機械感覺復合物蛋白具有密切的物理關系，并且在FSS條件下，通過CAR與機械感覺復合物或其他蛋白質之間的相互作用，PECAM-1的磷酸化受CAR調控。
用針對 CAR的 siRNA（a、c、e）或編碼 CAR 的標記質粒（b、c）轉染的 HUVECs 暴露于 FSS。評估 Src 在 Y416（活性形式）和 Y527（抑制形式）、PI3K、Akt 和 eNOS（S1177）處的磷酸化。
內皮 CAR 表達受 FSS 調節。擾動流增加，層流剪切應力降低，ECs 中的 CAR 表達，CAR 表達的這些變化是通過 KLF2-AP-1 軸調節的。擾流誘導的 CAR 抑制 PECAM-1 的磷酸化，導致通過磷酸化 Src、PI3K、Akt 和 eNOS 抑制內皮機械轉導信號。因此，CAR 通過阻斷 PECAM-1 磷酸化來調節 ECs 中的機械轉導，從而影響內皮功能和血管病理生理學。
總之，這項研究提供了新的證據，表明 FSS 調節 ECs 中的 CAR 表達，并且擾動流通過 KLF2/AP-1 途徑上調 CAR。抑制 CAR 表達通過抑制 NF-κB 活化來下調促炎基因的表達，從而減少體外和體內流動紊亂下的內皮炎癥，然后延遲動脈粥樣硬化形成。CAR 抑制 PECAM-1 的磷酸化，從而抑制內皮機械轉導信號。這些結果表明，CAR 是 ECs 中機械轉導的重要調節劑，通過阻斷 PECAM-1 磷酸化發揮作用，從而影響內皮功能和血管病理生理學。因此，CAR參與了血管功能的維護，并有望成為治療血流紊亂性血管疾病（如動脈粥樣硬化）的靶點。
參考文獻：Chung J, Kim KH, An SH, Lee S, Lim BK, Kang SW, Kwon K. Coxsackievirus and adenovirus receptor mediates the responses of endothelial cells to fluid shear stress. Exp Mol Med. 2019 Nov 27;51(11):1-15. doi: 10.1038/s12276-019-0347-7. PMID: 31776326; PMCID: PMC6881322.
原文鏈接：http://www.naturethink.com/?news/242.html
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