熱原（內毒素）檢測

鑒于熱原對人體的不良反應的效果和多樣性，注射用藥終產品放行都必須強制進行細菌內毒素測試（BETs），以確保患者用藥安全。在制藥行業，特別是注射用藥，對細菌內毒素進行可靠和有效的檢測是重要環節。標記為無熱原或無菌的注射或植入產品必須進行內毒素檢測放行。許多原材料檢查也必須進行內毒素檢測方能用于GMP生產，以達到設計標準的質量要求。

家兔熱原檢測法（RPT）

家兔的體溫變化非常敏感，它們對許多病毒和致病菌非常敏感，具有能客觀反映各類藥品中熱原在生物體內引起發熱情況的特點。通過家兔的預先感染，可以進行許多抗傳染藥物的研究，因此可以作為熱原試驗的實驗動物模型，常作為研究發熱、解熱藥和檢查致熱原。雖然兔子是最常用的試驗動物，但人類被認為是對熱原最敏感的動物。

Seibert在1923提出用家兔檢測熱原，該方法于1942年首次被美國藥典收錄，簡稱“家兔法”（RPT），是用于藥品和醫療器械熱原體內檢測的方法。中國藥典1953年版開始收載該方法，隨后的世界各國藥典都以動物熱原檢查法作為藥品質量監測的方法之一。歐洲藥典也于1986年首次發布該方法，通過測量兔子通過靜脈注射待測物質的無菌溶液引起的體溫升高進行檢測。家兔熱原檢查法可在規定時間里觀察到家兔的體溫變化，相應反應了熱原質引起哺乳類動物復雜的體溫反應過程，為保障藥品質量和用藥安全發揮了重要作用。

單核細胞活化反應測定法(MAT)

但RPT也存在各種局限性，例如：靈敏度較低、無法區分Endotoxin和NEP；試驗動物受到藥品的藥理活性干擾，而影響體溫變化（如放射性藥品、抗生素、生物制品等），實驗結果難以判斷；無法應用于非靜脈注射藥物；兔子致命的過敏性休克的可能性；動物飼養和測試設備及實驗費用；屬于定性反應，實驗結果和熱原很難進行量的換算。

鑒于這些限制，以及歐盟為減少動物用于科學目的所做的努力，歐洲藥典2010在通則2.6.30新增單核細胞活化試驗(MAT)熱原檢測方法，為RPT提供了一種體外替代方案，能夠檢測內毒素和非內毒素熱原，在動物福利方面向前邁出的重要一步。USP<151>也收錄了MAT熱原檢測方法。2020年版《中國藥典》通則9301“注射劑安全性檢查法應用指導原則”中增加單核細胞活化反應測定法(MAT)方法。用于滿足技術藥物發展的現狀和解決傳統內毒素檢查法不能滿足新型產品安全性控制需求這個難題。
 

單核細胞活化反應測定法(MAT)原理

細菌內毒素的鱟試劑檢查法（LAL/TAL）

細菌內毒素檢查法又稱鱟試劑法，是利用鱟試劑與細菌內毒素發生凝集反應，以檢測或量化藥品中因革蘭陰性菌產生的細菌內毒素含量是否符合規定的一種方法。此法以其快速、靈敏、經濟、重現性好等特點得到了日益廣泛的應用，并有取代傳統的熱原檢查法的發展趨勢。
 

美國動物學家FredericBang在1956年研究鱟的血液循環時，和助手JackLevin發現細菌產生的內毒素導致的凝血機理。1968年，他們初步闡明這種血液凝固是由于革蘭陰性細菌內毒素激活了鱟血變形細胞溶解物的酶，使溶解物中的可溶性蛋白變成凝膠，這種凝固反應極其靈敏。開發出了一種的細菌檢測劑——鱟試劑（LAL，LimulusAmebocyte Lysate，鱟阿米巴樣細胞裂解物）。
 

內毒素檢測方法發展史

根據鱟血來源不同，一般分為LAL（美洲鱟試劑）/TAL（東方鱟鱟試劑），鱟試劑檢測法是一種可靠、靈敏、特異性強的內毒素檢測方法，也是監管機構主要的推薦方法，應用廣泛。基于鱟試劑發展出來的主要內毒素檢測方法包括兩種：凝膠法和光度測定法，后者又包括濁度法和顯色基質法。供試樣品檢測時，可使用其中任何一種方法進行試驗。當測定結果有爭議時，除另有規定外，以凝膠法檢測結果為準。細菌內毒素的量用內毒素單位（EndotoxinUnit, EU）表示。

模擬鱟試驗級聯反應階段，2003年以來，基于重組因子C（rFC）的細菌內毒素檢測方法由于可替代動物源鱟試劑和原料可控性、抗干擾能力強等特點，被廣泛用作內毒素檢測的替代方法。有研究比較了LAL方法和rFC檢測數據，結果顯示幾種方法的檢測結果是可比的。重組C因子內毒素檢測方法可以用于藥典凝膠法和光度法的有效替代。
 

不同鱟試劑檢測方法和重組C因子檢測方法檢測結果比較(KQCL-Lonza動態顯色法試劑盒；PyroGene-Lonza重組C因子法試劑盒；QCL-Lonza終點顯色法試劑盒；Turb-Lonza動態濁度法試劑盒)

因此，目前行業內共有四種常見的細菌內毒素檢測方法：凝膠法、比濁法、顯色法和rFC法，并在注射劑和醫療器械生產過程控制和產品放行質控檢測中有著重要的應用。比濁法、顯色法和rFC法是定量方法，凝膠法為定性或者半定量方法。每種方法都有自己的特點，使用者可以根據自己的樣品屬性、檢測需求和實驗室設備情況和法規要求進行相應選擇，以達到內毒素控制和熱原控制的效果，保證患者安全。
 

內毒素檢測方法

Lonza內毒素檢測產品一直走在行業尖端

Lonza（龍沙）內毒素產品于1970年代面世。半個世紀以來，為全球客戶提供包括細菌內毒素檢測試劑盒、內毒素檢測軟件、全自動內毒素檢測儀器在內的一站式解決方案，符合FDA21 CFR part 11和歐盟EUGMP附錄11法規要求，以服務于各類細胞制劑生產企業、制藥企業質控部門，可植入醫療設備和透析樣品質控以及科研院所等相關機構，其服務對象覆蓋70%的制藥100強企業，已用于國外大量藥物的放行上市，滿足出口型制藥企業的規模化熱源測定需求。
 

產品包括：鱟試劑凝膠法試劑盒；基于鱟試劑，用于定量檢測的動態顯色法試劑盒，動態濁度法試劑盒；不依賴于鱟試劑的重組C因子檢測試劑盒。LAL試劑可以實現產品的穩定供應。
 

此外，Lonza還提供PyroCell®MAT單核細胞活化反應測定法系統，高度敏感和可靠的用于復雜配方（如人類疫苗和基于細胞的生物制劑）的體外熱原檢測。
 

Lonza內毒素檢測系統及組成（試劑盒、軟件、儀器、自動化及周邊耗材試劑）