本文要點(diǎn)：新冠病毒（SARS-CoV-2）的早期發(fā)現(xiàn)是預(yù)防其傳播的有效途徑。新冠病毒抗原檢測是便捷的方法，但如何發(fā)展高靈敏度的有效診斷方法仍是一個挑戰(zhàn)。本文提出了一種基于近紅外二區(qū)窗口熒光發(fā)射納米顆粒的橫向流動分析方法( lateral flow assay，LFA)，用于新冠病毒抗原的靈敏檢測。得益于NIR-II熒光的高穿透性和低自體熒光，這種NIR-ⅡLFA可以增強(qiáng)SBR，使得SARS-CoV-2抗原的檢測限可降至0.01 ng·mL-1。在臨床拭子樣本測試中，NIR-II LFA優(yōu)于膠體金LFA，與聚合酶鏈反應(yīng)測試的總體一致性更高。NIR-II LFA可以成功檢測低抗原濃度(0.015 ~ 0.068 ng·mL-1)的臨床標(biāo)本，而膠體金LFA檢測失敗。NIR-II LFA可為新冠肺炎感染的早期診斷和大規(guī)模篩查提供一個高靈敏度、快速、經(jīng)濟(jì)有效的平臺。
 

NIR-II熒光納米顆粒是通過將有機(jī)染料封裝在聚苯乙烯(PS)納米顆粒中制備的。納米顆粒表面修飾的羧基，允許與胺功能化的單克隆抗體(mAbs117)進(jìn)行偶聯(lián)。與mAbs117偶聯(lián)后，納米顆粒(NIR-II nanoparticles@mAbs117)尺寸增大47 nm、表面變粗糙(Figure 1(a))。制備的納米顆粒分散在水中呈淡綠色，并顯示明亮的NIR-II熒光(Figure 1(b))。其紫外-可見-近紅外(UV-Vis-NIR)吸收光譜在806 nm處出現(xiàn)峰值，而熒光發(fā)射光譜在1046 nm處出現(xiàn)峰值(Figure 1(c))。
 

納米顆粒對于新冠病毒抗原進(jìn)行LFA檢測的原理如Figure 2 所示。LFA條帶由5部分組成:樣品墊（Sample pad）、結(jié)合墊（Conjugate pad）、NC膜（NC membrane）、吸收墊（Absorbent pad）和塑料襯底（Plastic backing）。NIR-II nanoparticles@mAbs117被固定在結(jié)合墊上。將N蛋白捕獲抗體(mAbs30)和鏈霉親和素分別置于NC膜上的測試線(T線)和控制線(C線)上，T線和C線之間的間隙約為3 mm。樣品液被滴加到樣品墊上后，在毛細(xì)力作用下流向吸收墊。在流動過程中，樣品中新冠病毒N蛋白將與結(jié)合墊上的nanoparticles@mAbs117形成 nanoparticles@SARS-CoV-2 N蛋白復(fù)合物。由于新冠病毒N蛋白與mAbs30之間的抗原抗體相互作用，該復(fù)合物在T線上被mAbs30抗體捕獲，形成三明治免疫復(fù)合物結(jié)構(gòu)。樣品中N蛋白越多，在試驗(yàn)線上聚集的夾心免疫復(fù)合物越多。隨著樣品繼續(xù)流動，生物素標(biāo)記的nanoparticles@mAbs117被鏈霉親和素捕獲在C線上。在808 nm激發(fā)并在1000 nm長通濾波器濾波后，可使用低成本的InGaAs光電探測器在室溫下記錄熒光信號。熒光信號與納米顆粒的數(shù)量呈正相關(guān)。通過對T線和C線的熒光信號強(qiáng)度積分，建立抗原濃度與熒光強(qiáng)度的對應(yīng)關(guān)系，可以得到定量的樣品濃度。基于此原理，建立了一種高靈敏度的SARS-CoV-2抗原橫向流動檢測方法，可用于SARS-CoV-2抗原的定量早期診斷。

優(yōu)化篩選出NIR-II nanoparticles@mAbs117的抗體載量和免疫測定時間為240 ng·mL-1和15min。隨后，通過檢測不同濃度的新冠病毒重組抗原，評估LFA的靈敏度。隨著N蛋白濃度的增加，T/C信號強(qiáng)度相應(yīng)增加(Figure 3(a))。T/C強(qiáng)度與N蛋白濃度在0.02-120 ng·mL-1范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。在檢測閾值附近進(jìn)行了一系列低濃度實(shí)驗(yàn)。通過空白加三倍標(biāo)準(zhǔn)差的平均信號強(qiáng)度計算，LoD降至0.01 ng·mL-1(Figure 3(b))。再現(xiàn)性是評價方法有效性的關(guān)鍵因素。在N蛋白濃度為0.5、10和100 ng·mL-1時，回收率估計分別為102.6%、98.9%和109.1%(Figure 3(c))。通過檢測甲型流感、乙型流感、S蛋白(SARS-CoV-2重組刺突蛋白)和N蛋白，驗(yàn)證了條帶的特異性。結(jié)果表明，本研究的條帶可以特異性識別新冠病毒，并且與其他蛋白沒有交叉反應(yīng)(Figure 3(d))。

從低抗原濃度的檢測中發(fā)現(xiàn)，T線與背景信號區(qū)分明顯：當(dāng)抗原濃度降低到0.1 ng·mL-1時，SBR高達(dá)3.46；當(dāng)抗原濃度低至0.01 ng·mL-1時，SBR仍可達(dá)到1.21，但T線看起來比較模糊(Figure 4(a))。與商業(yè)膠體金分析試劑盒進(jìn)行比較，在用相同抗體制備的膠體金檢測試劑盒中：當(dāng)抗原濃度稀釋到0.1 ng·mL-1時，T線不明顯；而0.5 ng·mL-1時SBR僅為1.23(Figure 4(b))。另一種商業(yè)膠體金型新冠病毒抗原試劑盒，當(dāng)抗原濃度稀釋至0.5 ng·mL-1時，T線不清晰。結(jié)果提示NIR-II LFA檢測新冠病毒抗原的敏感性高于膠體金LFA。

為進(jìn)一步驗(yàn)證NIR-II LFA的有效性，研究采集了30份臨床拭子樣本，包括18份COVID-19陽性樣本和12份COVID-19陰性樣本(由深圳疾病預(yù)防控制中心PCR證實(shí))。通過比較熒光強(qiáng)度分布曲線可以清楚地區(qū)分陽性樣品和陰性樣品。其中10例抗原濃度較低，范圍為0.015 ~ 0.068 ng·mL-1(Figure 5(a))。我們測試了相同條件下膠體金檢測方法 (WWHS Biotech, Inc.)。18份陽性樣本中僅檢出8例抗原濃度較高的病例(Figure 5(b))，其余10例抗原濃度較低無法與陰性樣品區(qū)分。如Figure 5(c)所示，NIR-II LFA優(yōu)于膠體金LFA，因?yàn)樗�可以減少假陰性樣品的數(shù)量。需要指出的是，標(biāo)本保存液和保存時間可能會影響臨床標(biāo)本抗原定量的準(zhǔn)確性。目前的結(jié)果表明，NIR-II方法在疑似病例或早期感染的情況下可以實(shí)現(xiàn)更敏感的COVID-19檢測，但仍需要對臨床COVID-19樣本進(jìn)行更詳細(xì)的研究，以供未來應(yīng)用。

參考文獻(xiàn)

https://doi.org/10.1007/s12274-022-4351-1

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