細胞凍存技術

1. 細胞凍存是將細胞儲存在低溫環境中，減少細胞代謝，實現長期儲存的一種技術。

2. 在大多數細胞系中，細胞會隨著衰老和演化不斷的積累改變，造成表型和基因型的“培養漂移”，在凍存過程中，適當的操作和合適的凍存條件可以減少細胞特性的改變或丟失，起到細胞保種的作用。因而，正確且成功的凍存對于細胞的長久應用起著非常重要的作用。

細胞凍存原理

1. 當溫度低至-70℃時，細胞內的酶活性全部停止，代謝活動停止，故實現長期保存的目的。

2. 隨著溫度降低，細胞內外的水分都會結晶，所形成的冰晶會造成細胞膜和細胞器的破壞，從而引起細胞死亡，特別是0~-20℃的階段，冰晶呈針狀，及其引發細胞損傷。在不加任何保護劑條件下直接凍存細胞時，細胞內和外環境中的水都會形成冰晶，能導致細胞內發生機械損傷、電解質升高、滲透壓改變、脫水、pH改變、蛋白變性等，能引起細胞死亡。

3. 常見的冷凍保護劑是甘油或二甲基亞砜（DMSO）。DMSO能快速穿透細胞膜進入細胞，降低冰點，延緩凍存過程，同時增加細胞膜的通透性，提高細胞內離子濃度，減少細胞內冰晶的形成，從而達到保護細胞的目的。
 

 

· 珍貴細胞保種

· 細胞株標準品制備

· 臍帶血干細胞、NK細胞凍存

細胞凍存的最佳時期

1. 用來凍存的細胞一般選擇在細胞對數生長期，匯合度約 90% 的時候，這時細胞生長狀態好，細胞數量也多，并且在收獲細胞前 24 小時換一次培養液。

2. 對培養物進行微生物污染物檢測，特別是支原體，確保細胞沒有任何的污染。在細胞的收集過程中，實驗操作要盡可能的溫和，避免細胞受損。

細胞凍存的速率

1. 細胞的冷凍速率最適控制在讓細胞有足夠的時間脫水而又不被過度脫水導致細胞損害。對大多數細胞來說，每分鐘降 1 至 3 ℃是合適的。

2. 梯度降溫法：4℃-30 min，20℃- 2h，-80℃冰箱冷凍過夜，次日將凍存管轉移到液氮罐中長期保存。

3. 細胞程序降溫盒，將準備好的細胞凍存管放進凍存盒，直接在-80℃過夜后就可以轉移至液氮罐中。

4. 在轉移存放位置的過程中一定要迅速，轉移時建議將凍存管放在干冰中恒溫，盡量避免轉移過程因溫度變化對細胞活力的影響。

凍存環境

1. 細胞也可以在-80℃冰箱保存幾個月左右的時間。

2. 細胞長期保存溫度是 -130 ℃或更低。

3. 液氮罐中氣態層溫度在 -140℃至 -180℃之間，細胞可保存在氣態層或浸入液氮中，如果可能最好保存在氣態層，因為這樣可避免由于有液氮進入凍存管而在拿出細胞時引起爆炸(但是這樣液氮罐內只能存儲少量液氮，需要經常添加)。

HyCyte™一步凍存液

HyCyte™凍存液是一種即用型、無血清、無需程序降溫的細胞“長期”凍存液，該產品配方使用已超過15年，原料均從日本進口，凍存品質與日本產品一致。

· 安全：無血清，不含異種動物成份

· 高效：復蘇后細胞保持高活性及快速增殖  能力，不影響細胞功能

1.細胞膜保護劑—可在細胞膜外瞬間形成一層保護膜，保護細胞不受細胞外冰晶的損害。

2. 滲透性保護劑—可迅速滲透至細胞內部，防止細胞內部產生大量冰晶，同時可保護細胞器，減少其在低溫下的損傷。

3. 細胞沉降穩定劑—可平衡細胞沉降速度，防止細胞在凍存過程中聚集成團。