酒精相關肝�。ˋLD）是常見的慢性肝病，經常導致肝硬化；隨著發病率上升，已成為肝移植的主要適應癥。ALD從酒精相關脂肪肝開始，到以肝臟炎癥為特征的亞臨床脂肪肝性肝炎，進而出現進行性纖維化，最終導致肝硬化。目前將近75%的ALD患者在發生失代償期肝硬化后才被診斷，導致錯過了最佳治療階段。肝病的準確診斷依賴活檢，這會導致1%的患者出現嚴重并發癥。而現有的非侵入性生物標志物在疾病早期準確性有限，嚴重減少了及時發現和干預疾病的機會。

2022年6月，馬克斯·普朗克生物化學研究所Matthias Mann團隊在Nature medicine（IF 50.768）上發表題為"Noninvasive proteomic biomarkers for alcohol-related liver disease“的研究文章，作者利用DIA蛋白質組學結合機器學習算法，成功確定了三組生物標志物，可以檢測顯著纖維化、輕度炎癥活動和任何脂肪變性。換言之，該研究標志物可檢測任何肝損傷，并幫助預測患者是否具有疾病進展風險，有巨大的臨床應用潛力。

研究材料

技術路線

研究結果

本研究人群來自三個隊列的參與者：1）腸肝軸-ALD隊列（GALA-ALD），n=459，具有隨訪數據的前瞻性隊列（連續招募的具有有害飲酒史的患者，代表疾病早期的無癥狀ALD）；2）腸肝軸-健康參與者（GALA-HP），n=137。與GALA-ALD相匹配的橫斷面隊列；3）獨立ALD驗證隊列，n=63，來自ALD篩查研究的橫斷面隊列。作者進一步統計了所有受試者的臨床特征。
 

表1 參與者基線特征

2. 蛋白組學：分析肝臟病變對肝臟和血漿蛋白質組的影響
 

肝臟蛋白質組檢測出717種獨特差異蛋白（占總量化蛋白的13%）。其中658種蛋白在纖維化階段，135種蛋白在炎癥活動階段，68種蛋白在脂肪變性階段發生顯著失調。纖維化對肝臟蛋白質組的影響最大、其次是炎癥；而炎癥過程中失調的所有蛋白質中84%在纖維化中失調。根據人類蛋白質圖譜的注釋對失調蛋白進行分組，發現隨著纖維化的增加，87%注釋為肝臟特異性的蛋白在肝組織中下調；相反，80%注釋為分泌的蛋白質被上調。在纖維化階段最相關的前20種蛋白中，主要是肝臟分泌的蛋白（如TGFBI 和 EMILIN1），纖維化相關蛋白（如IGFBP7和 TNXB）。此外，前20種驗證相關蛋白中約50%是細胞骨架蛋白，指征了炎癥過程中肝臟細胞結構變化。而脂滴蛋白PLIN2和脂肪酸結合蛋白4（FABP4）可作為NAFLD47患者從單純脂肪變性變向非酒精性脂肪肝炎的預測標志物，與肝脂肪變性相關的系數分別排在第1和第16位。
 

圖1 肝臟病變導致肝臟蛋白質重塑
 

血漿蛋白質組檢測發現，共225種蛋白在纖維化階段（206種）、炎癥活動（163種）和脂肪變性（48種）的組織學階段發生顯著變化。其中，隨著纖維化階段增加，134中蛋白上調、91中下調。在注釋為肝臟特異性或分泌的失調蛋白中，分別發現83%和64%被下調。下調的簇包含參與補體系統蛋白、凝血級聯反應相關蛋白、載體蛋白和和載體蛋白。相關性分析顯示，分別有106種、55種和5種蛋白與纖維化、炎癥和脂肪變性相關。其中補體成分C7、QSOX1和LGALS3BP與纖維化程度相關性最高（也是前三個與炎癥相關蛋白），具有纖維化和炎癥標志物潛力。

圖2 肝臟病變重塑了血漿蛋白質組

3. 數據分析：肝臟和血漿蛋白質組學數據整合

肝臟和血漿中總共有420種蛋白質被量化， 他們在二維空間中的水平表現出雙模態模式。其中一組蛋白質，肝臟和血漿的相對豐度排名在很大程度上是相關的 （“對角聚類”），而另一組沒有相關性（“垂直聚類”）。相關性分析顯示，112種蛋白在肝臟和血漿樣本之間存在顯著關聯。肝臟和血漿蛋白質組的協方差分析中找到46種共調控蛋白，功能涉及免疫和炎癥反應、細胞粘附、ECM組織、蛋白酶抑制劑和細胞內酶等。
 

圖3 肝臟-血漿蛋白質組整合

4. 機器學習：ALD早期病理學生物標志物

作者比較了22種機器學習分析方法，并確定邏輯回歸模型作為最終分類器。作者選定三組標志物分別識別顯著纖維化（9種蛋白）、輕度炎癥活動（6種蛋白）和任何程度的肝脂肪變性（6種蛋白）。在包含三組標志物的22個蛋白中，有8種在血漿和肝臟中受到協同調節，包括 C7、LGALS3BP、TGFBI、ALDOB、CLEC3B、FBLN1、ATRN 和 SERPINF1。重要的是，這三組標志物對顯著纖維化（AUC=0.90，95% CI=0.899–0.905）、輕度炎癥（AUC=0.85，95% CI 0.851–0.858）和脂肪變性（AUC=0.91，95% CI 0.907– 0.915）均有很好的診斷效能，且優于現有的15項臨床測試模型。
 

圖4 基于血漿蛋白質組的纖維化、炎癥和脂肪變性預測模型

5. 獨立隊列驗證模型性能

驗證結果顯示，在健康對照組（n=136）中，該模型正確排除了顯著纖維化、晚期纖維化和輕度炎癥，其準確率分別是99%、100%和98% ，約15%的個體被歸為脂肪變性陽性，與他們BMI與ALD隊列一致相關。此外，在有酒精濫用史且由于肝硬度低而未進行活檢的患者子集（n=97）中，該模型排除顯著和晚期纖維化的準確率分別是93%和100%。接著，作者在獨立的ALD隊列（n=63）中進行驗證，顯著纖維化和輕度炎癥的模型效能高于其他同類模型，ROC-AUC分別是0.87和0.81。更重要的是，顯著纖維化的蛋白組學模型相比于現有標志物，對患者肝臟相關事件（LRE）具有最高的判別準確率（Harrell's C  = 0.900 ，3年和5年AUC分別是 0.945和0.933）；對于全因死亡率，蛋白組學模型也表現最好（Harrell's C  = 0.789、3 年和 5 年 AUC 分別 = 0.836 和 0.818）。
 

圖5 模型性能驗證和預測能力評估
 

 小編小結