Cyanine 染料的分類、活化基團的選擇和標記反應操作
CY 為花菁 (Cyanine) 的縮寫，經典的菁染料含有兩個含氮雜環，分子內部含有由甲川基 (CH)n 組成的共軛鏈，n 可為奇數或偶數。吸光度和熒光波長可通過選擇聚次甲基橋的長度來控制：越長的花菁素具有較高的吸光度和發射波長 (圖 1 所示)。根據鏈中的碳原子數，菁類由甲川基被分為一甲基 (CY1，n=0)、三甲基 (CY3，n=1)、五甲基 (CY5，n=2) 和七甲基 (CY7，n=3)。
圖 1. 經典花菁素結構及發射光譜示意圖
CY 染料分為非磺化花菁和磺化花菁。兩者的光譜特性基本相同，在 DNA 和蛋白質的標記中，它們是可互換的，兩種均可用于標記生物分子。磺化花菁染料具體水溶性，且不易在水中聚集，是抗體和蛋白標記的首選。
圖 2. 共聚焦顯微鏡觀察患者腎、肝和腫瘤的組織切片中 Cy5 的攝取情況[3]
文中所用 Cy5 來自 MCE
根據需要標記的生物分子的可標記基團 (胺基、醛基或巰基) 以及酸堿性，選擇相應的活化染料和反應條件。為減少空間位阻影響，CY 染料常做各種修飾，具體如下：
1) Succinimidyl ester (SE) 修飾：
該類型 CY 染料可與蛋白的氨基末端或伯胺反應，從而實現包括多肽、抗體等的蛋白標記。標記反應相對于游離酸形式，空間位阻更小，反應更加穩定，高效；
如 Shiqi Huang 等人研制出一種經過修飾的納米載體，用于治療因黑色素瘤導致的肺部腫瘤，研究人員用 Cy5-SE 標記了四種修飾的納米顆粒導入小鼠體內，并觀察肺部熒光圖像，進而確定納米顆粒的聚集情況。結果表明，小鼠的肺部有大量的 Cy5-SE 標記的納米顆粒靶向聚集，延緩了腫瘤的生長，該文章用熒光標記的方法證明了納米載體抗腫瘤活性實驗的可靠性。
圖3. CY5-SE 標記四種修飾載體蛋白的熒光圖像[2]
2) Hydrazide (酰肼) 修飾：
該類型 CY 染料可與蛋白等生物分子的醛基反應，多用于神經元細胞的電極失蹤和神經縫隙連接硏究；
該類型 CY 染料還可用于糖基化抗體的標記；如 J.E.Noble 等用 Hydrazide 修飾的 CY3對四種糖基化抗體進行偶聯 (半乳糖、唾液酸、N 乙酰氨基葡萄糖和甘露糖)，得到穩定的 CY3-Hydrazide 標記抗體。
3) Maleimide (馬米酰亞胺) 修飾：
該類型 CY 染料可與蛋白等生物分子的巰基反應，實現高效標記。
1) 光譜窄，信號強；
2) 花菁類染料的摩爾吸光系數高于其他熒光染料；3) 磺化花菁類染料易溶于水，對組織細胞毒性小，適用于動物和細胞實驗；
4) 熒光波段在近紅外區段的組織透過性更好。
以 NHS 活化脂 CY 標記蛋白為例，如下圖所示：
將蛋白溶液與配置好的染料工作液倒入反應溶劑中 → 用移液器上下輕打混勻 → 常溫下靜置或輕微混動反應 3-5 個小時 (可過夜) → 反應結束后進行透析除去未標記染料 → 避光放置在 4°C 保存
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λex/ λem |
Description |
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488/520 |
是一種花青染料，可標記多肽，蛋白和寡核苷酸種的氨基。 |
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| Cy2-SE (iodine) |
488/520 |
Cy2-SE (iodine) 為 Cy2 的 SE 修飾所得，可標記多肽、蛋白和寡核苷酸中的氨基。 |
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555/580 |
Cy3 (Cyanine 3) 是一種發橘黃色熒光的花青素熒光染料。可以用 530nm-561nm 的激光束激發后用 TRITC 的濾片觀察。 |
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555/580 |
Cy3-N3 是 Cy3 疊氮化物熒光染料，用于多肽、蛋白和寡核苷酸中的氨基。 |
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555/580 |
CY3-YNE (Sulfo-Cyanine3-alkyne) 是一種染料，可用于標記可溶性蛋白、肽和寡核苷酸/ DNA。 |
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659/670 |
Cy5 是明亮的紅色熒光染料，用于標記肽，蛋白質，寡核苷酸的氨基基團的反應染料。 |
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659/670 |
Cy5-SE (Cy5 NHS Ester) 是一種用于標記肽，蛋白質，寡核苷酸的氨基基團的反應染料。 |
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673/707 |
Cy5.5 (Sulfo-Cyanine5.5) 是用于標記生物分子的近紅外熒光染料，可用于小動物體內成像，也常常適用于對背景熒光干擾的實驗。 |
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673/707 |
Cy5.5-SE (Cyanine5.5 NHS ester) 為 CY5 的 NHS 修飾所得，可標記多肽、蛋白和寡核苷酸中的氨基。 |
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720/790 |
CY7-SE (Sulfo-Cyanine7 Succinimidyl Ester) 是一種近紅外熒光標記試劑，常用于小動物體內成像，也用來標記核酸，蛋白，多肽，納米粒，多聚物等。 |
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參考文獻
1.. X Shi, Y Jung, LJ Lin, C Liu, C Wu, IKO Cann, Quantitative fluorescence labeling of aldehyde-tagged proteins for single-molecule imaging Nat Methods. 2012 Apr 1;9(5):499-503
2. JE Noble, E Cerasoli.Fluorescent labeling of protein analysis.3. Arindam Pramanik, Zexi Xu, Shazana H Shamsuddin, et al. Affimer Tagged Cubosomes: Targeting of Carcinoembryonic Antigen Expressing Colorectal Cancer Cells Using In Vitro and In Vivo Models. ACS Appl Mater Interfaces. 2022 Mar 9;14(9):11078-11091.
