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谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)試劑盒使用說明書

瀏覽次數(shù):2015 發(fā)布日期:2022-5-7  來源:本站 僅供參考,謝絕轉(zhuǎn)載,否則責(zé)任自負(fù)
谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)說明書
分光光度法50管/48樣
 
    意:正式測定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。
測定意義:
GSH-Px是谷胱甘肽氧化還原循環(huán)中催化還原型谷胱甘肽(GSH)氧化的主要酶之一。GSH-Px不僅能夠特異地催化還原型谷胱甘肽與ROS反應(yīng),生成氧化型谷胱甘肽GSSG,從而保護(hù)生物膜免受ROS的損害,維持細(xì)胞的正常功能;而且具有保護(hù)肝臟、提高機(jī)體免疫力、拮抗有害金屬離子對機(jī)體的傷害和增加機(jī)體抗輻射等能力。

測定原理:
GSH-Px催化有機(jī)過氧化物氧化GSH,產(chǎn)生GSSG;谷胱甘肽還原酶(GR)催化NADPH還原GSSG,再生GSH,同時(shí)NADPH氧化生成NADP+;NADPH在340 nm有特征吸收峰,而NADP+沒有;通過測定340 nm光吸收減少速率來計(jì)算GSH-Px活性。

自備儀器和用品:
紫外分光光度計(jì)、低溫離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)節(jié)移液器、1mL石英比色皿和蒸餾水。

試劑組成和配置:
試劑一:液體100mL×1瓶,室溫保存。
試劑二:粉劑×1瓶,4℃保存。
試劑三:液體20μL×1支,-20℃保存。
試劑四:液體200μL×1瓶,4℃保存。

粗酶液提取:
  • 組織:按照組織質(zhì)量(g):試劑一體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL試劑一)進(jìn)行冰浴勻漿。8000g,4℃離心10min,取上清置冰上待測。
  • 細(xì)菌、真菌:按照細(xì)胞數(shù)量(104個(gè)):試劑一體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬細(xì)胞加入1mL試劑一),冰浴超聲波破碎細(xì)胞(功率300w,超聲3秒,間隔7秒,總時(shí)間3min);然后8000g,4℃,離心10min,取上清置于冰上待測。
  • 血清等液體:直接測定。
測定操作:
1. 分光光度計(jì)預(yù)熱30 min,調(diào)節(jié)波長到340 nm,蒸餾水調(diào)零。
2. 混合試劑在25℃或者37℃(哺乳動物)水浴中預(yù)熱30min。
3. 混合試劑配制:臨用前,在試劑二中加入試劑一40 mL,充分震蕩溶解后加入全部試劑三,混勻。(注意:必須現(xiàn)配現(xiàn)用,當(dāng)天使用完)
4.試劑四的稀釋: 吸取21.5μL試劑四,加入5mL水充分混勻,臨用前配制,配制好的試劑當(dāng)天使用。
5. 測定管:依次在1mL石英比色皿中加入100μL上清液、800μL預(yù)熱的混合試劑、100μL稀釋后的試劑四, 迅速混勻后于340nm處測定第30 s和第210s的吸光值,分別記為A1和A2,△A= A1﹣A2。

計(jì)算公式:
(1). 按蛋白濃度計(jì)算
GSH-Px活力單位定義:一定溫度中,每mg蛋白每分鐘催化1nmol NADPH氧化為1個(gè)酶活單位。
GSH-Px (nmol/min/mg prot)=[△A÷ε÷d×V反總×109]÷(Cpr×V樣)÷T=536×△A÷Cpr
(2). 按樣本質(zhì)量計(jì)算
GSH-Px活力單位定義:一定溫度中,每g樣本每分鐘催化1nmol NADPH氧化為1個(gè)酶活單位。
GSH-Px (nmol/min/g)=[△A÷ε÷d×V反總×109]÷(W×V樣÷V樣總)÷T=536×△A÷W
(3)按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算
活性單位定義:一定溫度中,每104個(gè)細(xì)胞每分鐘催化1nmol NADPH氧化為1個(gè)酶活單位。
GSH-Px (nmol/min/104 cell)= [△A÷ε÷d×V反總×109]÷(細(xì)胞數(shù)量×V樣÷V樣總)÷T=536×△A÷細(xì)胞數(shù)量
(4)按液體體積計(jì)算
活性單位定義:一定溫度中,每毫升液體每分鐘催化1nmol NADPH氧化為1個(gè)酶活單位。
GSH-Px (nmol/min/mL)=[△A÷ε÷d×V反總×109]÷V樣÷T=536×△A
ε:NADPH摩爾消光系數(shù)6.22×103L/mol/cm;V反總:反應(yīng)體系總體積,1000μL=0.001 L;106:1mol=1×106μmol; Cpr:上清液蛋白濃度(mg/mL);V樣:加入反應(yīng)體系中上清液體積,100μL =0.1 mL;V樣總:加入提取液體積,1mL;W,樣本質(zhì)量,g;T:反應(yīng)時(shí)間,3 min。
 
注意事項(xiàng):
(1)樣品處理等過程均需要在冰上進(jìn)行,且須在當(dāng)日測定酶活力;
(2)混合試劑和底物液須臨用前配制,配完后置于冰上,當(dāng)天使用完;
(3)測定過程操作須迅速;
(4)細(xì)胞中GSH-Px活性測定時(shí),細(xì)胞數(shù)目須在300萬-500萬之間,細(xì)胞中GSH-Px的提取時(shí)可加試劑一后研磨或超聲波處理,不能用細(xì)胞裂解液處理細(xì)胞。
發(fā)布者:上海雅吉生物科技有限公司
聯(lián)系電話:021-34661276
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