高光譜受激拉曼散射顯微術對植物組織進行高光譜化學成像
受激拉曼散射（SRS）顯微術利用基于分子振動特征的化學特異性，可實現無標記生物成像。超光譜SRS成像可以獲得每個像素的分子振動光譜，不僅能夠研究各種生物分子的光譜差異，還可根據它們的光譜差異區分出不同成分。然而由于光譜差異的細微性，以前的無標記SRS成像可辨別的成分的數量只有4個。日本研究人員Takanori Iino等使用高光譜SRS對植物組織進行了成像，包括山茶（Camellia japonica）葉子、擬南芥（Arabidopsis thaliana）根和苔類植物（Marchantia polymorpha L）的葉狀體。表明SRS可以在沒有標記的情況下區分苔類植物中多達6種成分。結果證明超光譜SRS成像可用于無標記多色成像分析植物組織中的各種生物分子。文章以“Multicolour chemical imaging of plant tissues with hyperspectral stimulatedRaman scattering microscopy”為題發表于ROC Analyst。
背景
觀察各種生物分子的分布對理解生命系統的機制很重要。受激拉曼散射（Stimulated Raman scattering, SRS）顯微技術可實時獲取分子振動圖像并得到廣泛應用，如無標記成像各種細胞和組織中的生物分子、代謝成像、超多路成像。近期開發出的幾種超光譜SRS成像方法可以獲得每個像素的分子振動光譜，以區分出不同化學成分，實現多色無標記成像。
但高光譜SRS顯微術辨別不同分子的能力還有待充分開發�？紤]到典型生物分子的光譜寬度（約10cm-1）與碳-氫（C-H）拉伸區寬度（約200cm-1）之比，原則上高光譜SRS可以根據分子振動光譜的差異區分多達10種以上成分。而事實上在C-H拉伸區高光譜SRS成像可以區分的成分數量通常為3-4個，因為典型的生物分子在C-H拉伸區往往具有相似的光譜。高光譜SRS圖像的光譜相量分析不僅可以利用光譜特征差異，還可利用強度差異在哺乳動物細胞中實現五種成分分類，但這種分類缺乏形態學細節。有報道在指紋區對植物組織進行拉曼成像應用，指紋區光譜特征比C-H拉伸區更豐富，最終多元分解出6種成分。然而拉曼成像受到各種背景信號的影響，可能會影響分解結果，因此不同的分解算法間似乎仍然難以獲得一致的結果。
本研究在C-H拉伸區使用超光譜SRS顯微技術，證明能夠對完整植物組織進行無標記多色成像。具體而言，對山茶葉（Camellia japonica）進行三色成像，對擬南芥（Arabidopsis thaliana）葉、初生根頂端和中部進行四色成像，對苔類植物（Marchantia polymorpha L.）葉狀體進行六色成像。預期在植物組織中生物分子組成研究方面，超光譜SRS顯微術能夠成為一種有效的無標記成像分析工具。
圖1 自制SRS顯微鏡示意圖。使用（i）雙色同步皮秒泵浦脈沖和波長可調的斯托克斯脈沖；（ii）由共振振鏡掃描儀和普通振鏡掃描儀組成的X-Y掃描儀；（iii）物鏡將泵浦和斯托克斯脈沖聚焦到樣品上（下）并收集通過樣品傳輸的脈沖（上）；（iv）提取泵浦脈沖的濾光器，泵浦脈沖由硅檢測器檢測，硅檢測器連接到自制的鎖定放大器以獲取SRS信號。
結果
首先獲得山茶（Camellia japonica）葉子的SRS成像。圖2a為葉子的數據集舉例。從測量的超光譜SRS數據中手動提取光譜基（圖2b）。根據光譜形狀和形態推測，2940cm-1處顯示峰（CH3拉伸模式）的是細胞壁（黃線）、2850-2930cm-1處顯示平坦響應（烷基鏈）的是飽和脂肪酸（品紅線）、源于約3200cm-1處羥基拉伸模式的低波數尾部的是水（黑線）。各成分的圖像如圖2c所示。合成的多色圖像如圖2d所示，其中品紅色和黃色部位的形態與角質層蠟質層和細胞壁的形態一致。另外這些成分的重疊分布（雙向箭頭所示的黃褐色部位）證實了細胞壁-角質層連續體的存在，其作用是調節分子運輸進出植物體，影響對不同病原體感染的反應。
圖2 山茶花一片葉子的SRS成像。（a）葉片橫截面積的SRS圖像數據集示意，由91幅光譜圖像組成。為清晰起見對圖像進行了裁剪。（b）用作光譜基的振動光譜。（c）每種成分的圖像。（d）多色圖像。比例尺10 μm。雙向箭頭表示細胞壁-角質層連續體。
圖3為擬南芥（Arabidopsis thaliana）的SRS圖像，擬南芥是植物分子生物學和遺傳學研究中的典型模式物種。具體來說，對蓮座葉和初生根的中部和頂端進行了高光譜SRS成像。所有擬南芥樣本中，都能將SRS數據集分解成四個組成部分。在蓮座葉（圖3a）中，推測提取的光譜分別是細胞壁（紅線）、由于雙光子吸收而表現出寬光譜響應的色素（綠線）、在2850和2880cm-1處表現出尖銳峰的蠟酯（藍線），和水（黑線）。分解組分的空間分布與細胞形態一致。
在初生根的中部（圖3b）鑒別出四個光譜，推測為次生細胞壁（紅線）、在2930cm-1處顯示峰值，在2910cm-1處信號比木質素小的蛋白質（綠線）、在2850至2930cm-1處顯示平坦響應（烷基鏈）的飽和脂肪酸（藍線）、水（黑線）。同樣，分解成分的空間分布與導管中次生細胞壁、胞質溶膠和木栓質層的形態一致，其中木栓質層似乎存在于內皮層細胞的表面，這意味著可以觀察到凱氏帶（Casparian strip），一種細胞壁材料的帶，類似沉積在內皮層徑向和橫向壁中的栓蛋白。
在初生根的頂端（圖3c），推測光譜是細胞壁（紅線）、蛋白質（綠線）、在2910cm-1處有峰的多糖（藍線）、和水（黑線）。分解成分的空間分布與細胞壁、胞質溶膠和積累淀粉的淀粉質體的形態一致。由此使用SRS顯微術可以無標記的方式獲得四色圖像。 
圖3 擬南芥葉片和初生根的SRS成像。（a）蓮座葉。（b）初生根的中部。（c）初生根的尖端。（i）、（ii）和（iii）分別為用作光譜基的提取光譜、每種成分的圖像和合并的SRS圖像。（a）-（c）中的（iii）合并圖像顯示了各種結構，如（a）中細胞壁（紅色）、葉綠素（綠色）和角質層（藍色）；（b）中次級細胞壁（紅色）、胞質溶膠（綠色）和存在于內皮層細胞表面的片層上的木栓質層（藍色）；（c）中細胞壁（紅色）、胞質溶膠（綠色）和淀粉體（藍色）。
圖4為地錢（Marchantia polymorpha L.）葉狀體的SRS圖像，提取了六個光譜（圖4a）用作光譜基。推測提取的光譜為：范圍2850-2930cm-1寬光譜（烷基鏈），在3010cm-1處具有尖峰（C-C雙鍵相關的C-H拉伸模式）的不飽和脂肪酸（紅線）、色素（綠線）、油體中包含的次級代謝物（可能是萜類化合物和芳香成分的高度多樣混合物）（藍線），其在2910cm-1（CH2反對稱拉伸模式）和3050cm-1（芳香C-H拉伸模式）顯示出強峰、飽和脂肪酸（品紅線）、細胞壁（黃線）和水（黑線）。圖4b顯示了分解成分的空間分布，與脂滴、葉綠體、油體、角質層蠟層和細胞壁的形態一致。圖4c為葉狀體的合并SRS圖像，展示了通過超光譜SRS成像獲得的無標記六色成像圖。
圖4 地錢（Marchantia polymorpha L.）葉狀體的SRS成像。（a）提取光譜用作光譜基。（b）每種成分的圖像。（c）合并的SRS圖像，顯示不同結構：脂滴（紅色）、葉綠素（綠色）、油體（藍色）、角質層（洋紅色）、細胞壁（黃色）。（d）地錢全株的照片。
結論
本文利用高光譜SRS成像展示了各種類型植物組織的多色無標記成像，實現了通過線性解混方法區分微小的光譜差異。鑒于葉綠體、細胞壁和液泡等細胞器中積累的色素的自發熒光通常會妨礙熒光成像，高光譜SRS成像將特別適用于植物組織復雜結構的成像分析。
但該方法一個重要的技術挑戰是高光譜SRS數據集中成分的自動分類。本研究的光譜基是通過研究許多像素的光譜來手動提取的，既費時又費力，而且一旦它們反映的不是純成分，則偽矩陣反演給出的圖像也是成分的混合體。此外如果一些譜基不是線性獨立的，偽矩陣反演會產生噪聲圖像，這可表明組分的數量。目前還沒有成功量化光譜分析的準確性。雖然已有各種自動提取光譜基或分類不同細胞成分的算法，但使用這些算法提取多達六個成分似乎仍然較為困難，仍需要開發新的分類方法。
總之本文證明了超光譜SRS顯微術可用于植物組織的無標記多色成像，利用其分子識別能力，可對多達六種成分進行無標記多色成像。隨著光譜提取方法的發展，超光譜SRS顯微術的能力將得到進一步發展，成為植物組織無標簽多色成像分析的有力工具。
參考文獻：Iino, T. , et al. "Multicolour chemical imaging of plant tissues with hyperspectral stimulated Raman scattering microscopy." Analyst.
背景
觀察各種生物分子的分布對理解生命系統的機制很重要。受激拉曼散射（Stimulated Raman scattering, SRS）顯微技術可實時獲取分子振動圖像并得到廣泛應用，如無標記成像各種細胞和組織中的生物分子、代謝成像、超多路成像。近期開發出的幾種超光譜SRS成像方法可以獲得每個像素的分子振動光譜，以區分出不同化學成分，實現多色無標記成像。
但高光譜SRS顯微術辨別不同分子的能力還有待充分開發�？紤]到典型生物分子的光譜寬度（約10cm-1）與碳-氫（C-H）拉伸區寬度（約200cm-1）之比，原則上高光譜SRS可以根據分子振動光譜的差異區分多達10種以上成分。而事實上在C-H拉伸區高光譜SRS成像可以區分的成分數量通常為3-4個，因為典型的生物分子在C-H拉伸區往往具有相似的光譜。高光譜SRS圖像的光譜相量分析不僅可以利用光譜特征差異，還可利用強度差異在哺乳動物細胞中實現五種成分分類，但這種分類缺乏形態學細節。有報道在指紋區對植物組織進行拉曼成像應用，指紋區光譜特征比C-H拉伸區更豐富，最終多元分解出6種成分。然而拉曼成像受到各種背景信號的影響，可能會影響分解結果，因此不同的分解算法間似乎仍然難以獲得一致的結果。
本研究在C-H拉伸區使用超光譜SRS顯微技術，證明能夠對完整植物組織進行無標記多色成像。具體而言，對山茶葉（Camellia japonica）進行三色成像，對擬南芥（Arabidopsis thaliana）葉、初生根頂端和中部進行四色成像，對苔類植物（Marchantia polymorpha L.）葉狀體進行六色成像。預期在植物組織中生物分子組成研究方面，超光譜SRS顯微術能夠成為一種有效的無標記成像分析工具。
結果
首先獲得山茶（Camellia japonica）葉子的SRS成像。圖2a為葉子的數據集舉例。從測量的超光譜SRS數據中手動提取光譜基（圖2b）。根據光譜形狀和形態推測，2940cm-1處顯示峰（CH3拉伸模式）的是細胞壁（黃線）、2850-2930cm-1處顯示平坦響應（烷基鏈）的是飽和脂肪酸（品紅線）、源于約3200cm-1處羥基拉伸模式的低波數尾部的是水（黑線）。各成分的圖像如圖2c所示。合成的多色圖像如圖2d所示，其中品紅色和黃色部位的形態與角質層蠟質層和細胞壁的形態一致。另外這些成分的重疊分布（雙向箭頭所示的黃褐色部位）證實了細胞壁-角質層連續體的存在，其作用是調節分子運輸進出植物體，影響對不同病原體感染的反應。
圖3為擬南芥（Arabidopsis thaliana）的SRS圖像，擬南芥是植物分子生物學和遺傳學研究中的典型模式物種。具體來說，對蓮座葉和初生根的中部和頂端進行了高光譜SRS成像。所有擬南芥樣本中，都能將SRS數據集分解成四個組成部分。在蓮座葉（圖3a）中，推測提取的光譜分別是細胞壁（紅線）、由于雙光子吸收而表現出寬光譜響應的色素（綠線）、在2850和2880cm-1處表現出尖銳峰的蠟酯（藍線），和水（黑線）。分解組分的空間分布與細胞形態一致。
在初生根的中部（圖3b）鑒別出四個光譜，推測為次生細胞壁（紅線）、在2930cm-1處顯示峰值，在2910cm-1處信號比木質素小的蛋白質（綠線）、在2850至2930cm-1處顯示平坦響應（烷基鏈）的飽和脂肪酸（藍線）、水（黑線）。同樣，分解成分的空間分布與導管中次生細胞壁、胞質溶膠和木栓質層的形態一致，其中木栓質層似乎存在于內皮層細胞的表面，這意味著可以觀察到凱氏帶（Casparian strip），一種細胞壁材料的帶，類似沉積在內皮層徑向和橫向壁中的栓蛋白。
在初生根的頂端（圖3c），推測光譜是細胞壁（紅線）、蛋白質（綠線）、在2910cm-1處有峰的多糖（藍線）、和水（黑線）。分解成分的空間分布與細胞壁、胞質溶膠和積累淀粉的淀粉質體的形態一致。由此使用SRS顯微術可以無標記的方式獲得四色圖像。
圖4為地錢（Marchantia polymorpha L.）葉狀體的SRS圖像，提取了六個光譜（圖4a）用作光譜基。推測提取的光譜為：范圍2850-2930cm-1寬光譜（烷基鏈），在3010cm-1處具有尖峰（C-C雙鍵相關的C-H拉伸模式）的不飽和脂肪酸（紅線）、色素（綠線）、油體中包含的次級代謝物（可能是萜類化合物和芳香成分的高度多樣混合物）（藍線），其在2910cm-1（CH2反對稱拉伸模式）和3050cm-1（芳香C-H拉伸模式）顯示出強峰、飽和脂肪酸（品紅線）、細胞壁（黃線）和水（黑線）。圖4b顯示了分解成分的空間分布，與脂滴、葉綠體、油體、角質層蠟層和細胞壁的形態一致。圖4c為葉狀體的合并SRS圖像，展示了通過超光譜SRS成像獲得的無標記六色成像圖。
結論
本文利用高光譜SRS成像展示了各種類型植物組織的多色無標記成像，實現了通過線性解混方法區分微小的光譜差異。鑒于葉綠體、細胞壁和液泡等細胞器中積累的色素的自發熒光通常會妨礙熒光成像，高光譜SRS成像將特別適用于植物組織復雜結構的成像分析。
但該方法一個重要的技術挑戰是高光譜SRS數據集中成分的自動分類。本研究的光譜基是通過研究許多像素的光譜來手動提取的，既費時又費力，而且一旦它們反映的不是純成分，則偽矩陣反演給出的圖像也是成分的混合體。此外如果一些譜基不是線性獨立的，偽矩陣反演會產生噪聲圖像，這可表明組分的數量。目前還沒有成功量化光譜分析的準確性。雖然已有各種自動提取光譜基或分類不同細胞成分的算法，但使用這些算法提取多達六個成分似乎仍然較為困難，仍需要開發新的分類方法。
總之本文證明了超光譜SRS顯微術可用于植物組織的無標記多色成像，利用其分子識別能力，可對多達六種成分進行無標記多色成像。隨著光譜提取方法的發展，超光譜SRS顯微術的能力將得到進一步發展，成為植物組織無標簽多色成像分析的有力工具。
參考文獻：Iino, T. , et al. "Multicolour chemical imaging of plant tissues with hyperspectral stimulated Raman scattering microscopy." Analyst.
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