泛素化乙�；餐{控植物中蛋白質穩定性的變化
已知蛋白質組的動態可塑性是植物快速適應環境變化的重要機制之一，植物中廣泛存在的蛋白-泛素酶體調控了蛋白質的降解，而翻譯后修飾則是影響蛋白質穩定性的關鍵決定因素。最普遍的修飾之一是N末端的乙�；揎棧∟TA），該修飾由N乙酰轉移酶A（NatA）催化完成，但翻譯后修飾如何調控蛋白的穩定性仍有許多未知。
2022年2月10日，Nature Communications (IF 14.919)發表了一篇題為“Cotranslational N-degron masking by acetylation promotes proteome stability in plants”的文章，該文章采用泛素化蛋白組學和蛋白組學的方法發現依賴于NatA的NTA損傷會導致擬南芥蛋白質組的整體不穩定，并發現了一個新的degron，該degron標記了大多數非乙�；陌|蛋白并可通過泛素系統降解。
研究材料
擬南芥葉片
技術路線
· 步驟1：NatA的缺失增強了蛋白的降解；
· 步驟2：在NatA缺失的植物中，發生降解的蛋白質主要是NatA底物；
· 步驟3：在NatA缺失的植物中，胞質NatA底物是不穩定的；
· 步驟4：在NatA缺失的植物中，增強的蛋白質降解被翻譯的增加所抵消；
· 步驟5：植物中NatA底物的nonAc-X²/N-degron的鑒定。
研究結果
1. NatA的缺失增強了蛋白的降解
NatA由具有催化活性的亞基NAA10和核糖體錨定的亞基NAA15組成，通過對亞基的敲除，證明NatA的缺失導致了蛋白降解速度增加4倍（圖1a）且蛋白酶體活性增加（圖1b）、泛素化蛋白增多（圖1c）。結果說明NatA的缺失是通過提高內源性泛素化率和增加蛋白酶體的容量導致蛋白質降解速度增快的。
圖1 NatA的缺失會通過泛素-蛋白酶體系統影響蛋白的降解
2. 在NatA缺失的植物中，發生降解的蛋白質主要是NatA底物
對泛素化蛋白進行富集并進行蛋白組學分析，結果表明232個蛋白屬于顯著差異泛素化蛋白，且其中的162個蛋白屬于NatA的底物（圖1g）。GO分析發現在NatA缺失的植物中，泛素化蛋白主要是胞質蛋白(232個蛋白中有141個)，它們參與了不同的脅迫響應和蛋白質折疊(表1)。
表1 泛素化蛋白組學GO分析結果
3. 在NatA缺失的植物中，胞質NatA底物是不穩定的
盡管UPS誘導了NatA底物的降解，但NatA損失的植物葉片中的總蛋白含量不受影響(圖2a)。對穩態蛋白質的蛋白組學分析，發現在鑒定到的1238個蛋白中僅92個蛋白在NatA缺失的植物中發生了顯著變化，然而83%的低穩態蛋白均為NatA的底物（圖2b）。隨后作者選取顯著下調的ARKGR1和非顯著上調的ASROAS-TL A（兩者均為NatA的底物）進行后續驗證，
追蹤（蛋白穩定性實驗）結果顯示雖ARKGR1和ASROAS-TL A在NatA損失的植物中均顯著降解（圖2c），但加入蛋白酶體抑制劑MG132后，ASROAS-TL A隨即在NatA損失的植物中顯著的快速累積（圖2e），意味著不穩定的ASROAS-TL A未受影響的穩態水平是由于其受翻譯增強的結果。而ARKGR1不受增強的翻譯水平的影響（圖2e）。非NatA的底物MPPSAT5和MRETUBB4的穩定性不受影響（圖2d和2e）。
圖2 NatA的缺失不影響整體的蛋白水平，但選擇性顯著影響其底物
4. 在NatA缺失的植物中，增強的蛋白質降解被翻譯的增加所抵消
實驗結果發現，在NatA缺失的植物中，其翻譯水平較正常組織提高了4倍（圖3a），這是由于其對多種蛋白質的選擇性翻譯增強導致的（圖3b）。而這種翻譯增強是通過影響TOR蛋白（核糖體數量的主要調控蛋白）的活性引起的（圖3c和3d）。為尋找新翻譯的蛋白，作者進行了蛋白組學分析(共鑒定到913個蛋白)，結果發現新翻譯的蛋白大多為NatA的底物（圖3g）。泛素化蛋白組學和新翻譯蛋白的蛋白組學的結果進一步表明了由于N乙酰化水平受損所導致的NatA底物的選擇性失穩被其翻譯增強所抵消從而維持蛋白的穩態水平。
圖3 NatA缺失的植株中表現出較高的NatA底物翻譯率
5. 植物中NatA底物的nonAc-X²/N-degron的鑒定
為驗證NatA底物NTA的降低會增強蛋白的周轉，作者對NatA底物（ASROAS-TL A）和非NatA底物的半衰期進行了研究。結果發現NatA缺失植物中OAS-TL A的半衰期比正常植物中的顯著變短（圖4a），而非NatA底物的半衰期未發生變化（圖4b和4c）。為驗證位置2的Ala是引起蛋白不穩定的原因，作者構建了APSOASTL A，實驗結果發現APSOASTL A在正常植物中的半衰期與NatA缺失植物中ASROAS-TL A的半衰期一致，證明了Ala2中NTA的缺失導致了植物中OAS-TL A的不穩定。由此作者發現了不穩定信號并將其命名為nonAc-X²/N-degron。10個NatA底物蛋白進行了驗證（圖4d），結果表明NTA的缺失是蛋白質相對半衰期降低的原因。
圖4 NatA缺失植物中蛋白質半衰期的測定
小編小結
本研究發現在擬南芥中，NatA活性的減少會導致泛素-蛋白酶體系統的蛋白質降解速度增加4倍。同時通過增強TOR的活性增加了NatA底物蛋白的翻譯，這意味著NTA缺失觸發了反饋機制，以維持穩定的蛋白質豐度。蛋白質組、翻譯組和泛素組的定量分析表明，NatA底物響應了NTA缺失引起的降解和翻譯增加。一項針對NTA底物穩定性的靶向分析發現，NTA缺失通過一種以前未描述的、廣泛保守的nonAc/N-degron在植物中引發蛋白質的不穩定。因此，帶有乙�；瘶擞浀牡鞍踪|對于協調蛋白質組的穩定性至關重要。
中科優品推薦
翻譯后修飾是蛋白質復雜性的重要原因，許多調控網絡不僅受到蛋白表達水平的調控，而且也來自于翻譯后修飾，在某些調控過程中，翻譯后修飾甚至比蛋白更重要。
【中科新生命】提供多元化的、完善的翻譯后修飾組學服務，技術成熟、數據可靠、分析齊全。同時可聯合蛋白質組、代謝組等多個組學進行機制+表型完整的一體化研究，歡迎感興趣的老師前來咨詢。
