目前，基于“向自然學習”理念的“仿生偽裝”策略正日益流行。如紅細胞偽裝、細菌囊泡、病毒樣顆粒、靶向源細胞和細胞膜包裹納米微粒等都被認為是下一代基因載體的潛在策略。

在各種陽離子聚合物基因載體中，聚乙烯亞胺PEI作為基準聚合物載體被廣泛使用。聚乙烯亞胺能將DNA濃縮成納米大小的復合物(多聚體)，便于細胞內吞。聚乙烯亞胺一旦進入細胞，其質子海綿效應、緩沖能力和溶膜能力可促進多聚體的核內體逃逸。因此，基于聚乙烯亞胺的基因載體設計與評價對促進基因治療的發展具有重要意義，但其較高的正電荷量和缺乏基因轉移靶向性所帶來的固有細胞毒性等缺陷限制了其臨床應用。因此，雖然聚乙烯亞胺作為非病毒基因載體的杰出代表被廣泛關注和研究，但聚乙烯亞胺/DNA復合物在體內環境中的細胞毒性較高是阻礙聚乙烯亞胺被應用于臨床實驗的主要瓶頸之一。當前正在大力發展的先進的非病毒基因載體中，聚乙烯亞胺仍然被奉為評價非病毒基因載體效率的黃金標準。

受新型細胞膜包衣策略的啟發，本研究通過293T細胞膜對聚乙烯亞胺/DNA復合物進行“包衣”，制備復合物膠囊(293T細胞膜聚乙烯亞胺/DNA復合體293T-CPDc)作為DNA遞送平臺，以降低聚乙烯亞胺/DNA復合物的陽離子細胞毒性。具體如方案圖1所示，采用擠壓法制備293T-CPDc納米顆粒，通過DLS、Zeta電位、TEM、SDS-PAGE等多種方法對其進行表征。然后，可以通過對293T-CPDc的DNA攜帶能力、保護能力、釋放能力、細胞攝取效率、轉染效率和安全性的研究，系統地評價293T-CPDc復合物作為基因遞送系統發展的潛力。

圖1細胞膜“包衣”復合物基因遞送系統的主要研究思路。
（a）復合物的制備策略。（b）復合物的細胞攝入及包內轉運過程

主要試劑與設備

聚乙烯亞胺（M.W.30000）PEI30K

聚乙烯亞胺（M.W.70000）PEI70K

脂質體擠出器 美國Genizer

激光粒度儀 英國馬爾文

透射電子顯微鏡 德國徠卡公司

主要實驗方法與結果

1. 細胞培養

293T細胞使用完全培養基培養于37℃、5%CO2和90%相對濕度的細胞培養箱中，每隔1~2天，細胞生長密度達到80%～90%，傳代一次。

2. 293T細胞膜（293T-CM）的提取

293T細胞在含10%胎牛血清、1%雙抗的完全培養基中，37℃、5%CO2和90%相對濕度培養。待細胞匯合度達到80%～90%，不使用胰蛋白酶進行消化，直接將其吹下，4℃條件下3000rpm離心3min后吸除培養液，用4℃預凍的等滲1×PBS緩沖液將細胞重懸，4℃條件下3000rpm離心3分鐘后移除上清液。重復2-3次洗滌細胞。洗滌完成后，加入4℃預凍的0.1×PBS低滲緩沖液，置于4℃環境下放置30min，在低滲溶液中使細胞漲破。然后放入液氮中冷凍8秒，拿出后在室溫恢復液態，再放入液氮冷凍，這種快凍慢融會破壞細胞膜完整性，使其成為小的膜囊。如此反復凍融5次，待其恢復至液態后，在4℃條件下以14800rpm離心10min，棄掉上清，小的細胞器和細胞內含物被丟棄。收集沉淀，用無菌水將其重懸，并進行冷凍干燥。將所得固體293T-CM碎片重懸于無菌水中配制濃度為1mg/mL的293T-CM懸液待用，并于-20℃保存。

3. 293T-CPDc復合物的制備

（1）聚乙烯亞胺/DNA復合物最佳質量比的確定

以瓊脂糖凝膠阻滯實驗確定了不同分子量聚乙烯亞胺與DNA完全結合的質量比以及聚乙烯亞胺/DNA復合物轉染的最佳質量比。如圖2 (a)、（b）所示，隨著質量比的增加，聚乙烯亞胺30k與聚乙烯亞胺70k均表現出逐漸結合的趨勢，在質量比為1.5/1左右時，聚乙烯亞胺30k與DNA完全結合；質量比為0.75/1時，聚乙烯亞胺70k與DNA完全結合，DNA完全滯留于孔中。因此我們在這兩個質量比附近選取梯度進行細胞轉染實驗，確定聚乙烯亞胺/DNA復合物的最佳轉染質量比。由圖2 （c）可以看出，在質量比為1.5/1~4/1的范圍內，聚乙烯亞胺30k/DNA復合轉染效率呈現先增后減的趨勢，且在質量比為2.5/1時轉染效率最高，約為33.5%，之后隨著質量比的增加，轉染效率下降。同樣地，由圖2（d）可得，在質量比為0.5/1~2.5/1的梯度范圍內，聚乙烯亞胺70k/DNA復合物的轉染效率先增后減，在質量比為0.75/1時轉染效率最高，約為68.4%。

綜上，我們通過瓊脂糖凝膠電泳確定聚乙烯亞胺與DNA完全結合的質量比之后，在其一定的梯度范圍內，通過聚乙烯亞胺/DNA復合物的轉染效率篩選最佳質量比。根據實驗結果，我們確定2.5/1及0.75/1分別為聚乙烯亞胺30k/DNA復合物和聚乙烯亞胺70k/DNA復合物在后續實驗中的質量比。

圖2不同質量比下聚乙烯亞胺30k(a)、聚乙烯亞胺70k(b)
與DNA絡合的電泳遷移阻滯實驗以及不同質量比

（2）293T-CPDc復合物的制備

如圖3所示，我們首先對293T-CM進行提取制備，并根據前步選用的聚乙烯亞胺/DNA復合物最佳質量比，依靠聚乙烯亞胺表面大量正電荷與DNA表面負電荷間的靜電相互作用，分別制備聚乙烯亞胺30k/DNA與聚乙烯亞胺70k/DNA復合物。隨后將293T-CM分別與兩種復合物共混孵育，并通過Genizer脂質體擠出儀擠壓通過孔徑為200nm的聚碳酸酯多孔膜，使細胞膜對聚乙烯亞胺/DNA復合物進行“包衣”，制備得293T-CPDc復合物。

圖3 CPDc復合物的制備路線圖

4. 293T-CPDc復合物的表征

（1）293T-CPDc復合物的粒徑和Zeta電位

使用納米粒度儀對不同復合物的粒徑及Zeta電位進行了測定。由圖4可以看出，細胞膜碎片的粒徑大小為400nm左右，這可能是由于細胞膜碎片之間相互粘連導致粒徑過大；此外，由于細胞膜的主要結構為雙層磷脂，其中親水性的磷酸基團使得細胞膜呈現負電性。由于所有質量比的293T-CPDc復合物均由Genizer脂質體擠出儀擠壓通過200nm聚碳酸酯多孔膜，且此膜與常見用于除菌的微孔濾膜不同，其分布和大小較為均勻，孔道較直，因此使得復合物粒徑均勻分布在200nm上下，且隨著細胞膜質量的增加，293T-CPDc復合物的粒徑分布較為均勻，未出現較大波動。據圖4（b）可以看出，由于細胞膜“包衣”的擠壓作用，293T-CP70Dc復合物的粒徑較聚乙烯亞胺70k/DNA復合物進一步減小。

此外，由Zeta電位可以看出，兩種不同分子量的聚乙烯亞胺在與DNA結合后，仍具有較高水平的正電荷量，這會導致較大的陽離子細胞毒性，從而降低細胞攝入水平及轉染效率。可以看出，在加入細胞膜后，兩種復合物的正電荷量隨著細胞膜質量的增加而降低，成功的屏蔽了部分聚乙烯亞胺/DNA復合物表面的過量正電荷。隨著細胞膜質量增加，細胞膜逐漸過量，復合物的凈電荷表現為負電。

圖4 五種不同質量比的293T-CP30Dc（a）和293T-CP70Dc（b）復合物的粒徑及Zeta電位（mean±SD，n=3）。以293T-CM、聚乙烯亞胺30k/DNA和聚乙烯亞胺70k/DNA復合物作為對照。

（2）293T-CM對聚乙烯亞胺/DNA復合物的包封率

通過包封率測定，對兩種復合物包封的最佳質量比及擠壓次數進行篩選。由圖5（a）可以看出，隨著質量比的增加，293T-CM對聚乙烯亞胺30k/DNA復合物的包封率呈現出先上升后下降的趨勢，并且在質量比為2/2.5/1時包封率最高。在質量比為2/0.75/1時，隨著擠壓次數的增加，包封率大小并未有過大浮動。另由圖5（b）可以看出，隨著質量比增加，293T-CM對聚乙烯亞胺70k/DNA復合物包封率同樣呈現出先增后減的趨勢，這或許是由于加入過量的細胞膜反而抑制了其對聚乙烯亞胺/DNA復合物的包封。在質量比為2/0.75/1,293T-CM對聚乙烯亞胺70k/DNA復合物的包封率最高，且在此質量比下，隨著擠壓次數增加，包封率同樣先增后減，在擠壓15次時達到最高包封率約82%。因此，在之后的實驗中，我們均對復合物進行15次擠壓處理，獲得較高的包封率，以此進一步提高細胞攝入及轉染水平.

圖5 不同質量比及擠壓次數下293T-CM對聚乙烯亞胺30k/DNA（a）和聚乙烯亞胺70k/DNA（b）復合物的包封率

表1 不同質量比及擠壓次數下293T-CM對聚乙烯亞胺30k/DNA的包封率

表2 不同質量比及擠壓次數下293T-CM對聚乙烯亞胺70k/DNA的包封率