文章概述

三磷酸腺苷（Adenosine 50-triphosphate，ATP）是一種廣泛存在于體內的能量存儲分子。除了參與細胞內的能量代謝功能外，越來越多的證據表明，釋放到細胞外空間的ATP可以作為一種分子信號（嘌呤能遞質），能夠結合并激活離子型P2X受體以及代謝型P2Y受體。在神經系統中，釋放的ATP參與了多中生理病理過程，包括痛覺感受、機械/化學感知信號轉導、突觸傳遞、損傷、炎癥等。對于ATP在這些生理過程中的作用，目前的研究并未完全闡明。為了進一步研究ATP的生理功能，2021年12月22日，北京大學生命科學學院李毓龍教授團隊發表在《Neuron》期刊上發表題為“A sensitive GRAB sensor for detecting extracellular ATP in vitro and in vivo”的研究論文，該項工作展示了團隊最新開發的一種可遺傳編碼的熒光分子探針——GRABATP1.0（簡稱ATP1.0；GRAB：G protein-coupled receptor activation-based sensors），該探針以P2Y受體作為ATP的結合支架，能夠對細胞外的ATP進行高靈敏度、高選擇性以及高時空分辨率的實時測量。該項工作是李毓龍教授團隊在相繼開發了乙酰膽堿、多巴胺、去甲腎上腺素、血清素和腺苷等一系列分子探針之后的后又一重要成果，對于我們深入研究并理解ATP的生理功能具有重要意義。

 

核心觀點

1、ATP1.0是一個可遺傳編碼的細胞外ATP感受器；

2、ATP1.0對于細胞外ATP具有高敏感性和高時空分辨率；

3、ATP1.0可用于離體以及在體ATP釋放的實時監測。

研究結果分析

1. ATP1.0表現出卓越的細胞外ATP檢測性能

為了開發一個遺傳編碼的ATP熒光探針，研究者首先系統地篩選了能夠被ATP激活的G蛋白耦合受體（G protein-coupled receptors, GPCRs），包括人源的P2Y1、P2Y2、P2Y4、P2Y11、P2Y12和P2Y13等。以這些GPCRs作為支架，研究者將結構敏感的綠色熒光蛋白（circularly permuted enhanced GFP, cpEGFP）插入到這些受體結構中。其中hP2Y1在插入cpEGFP后表現出最佳的膜轉運和對ATP的響應性，因此隨后研究者選擇了基于hP2Y1的嵌合體ATP0.1進行進一步優化，并且最終得到了對ATP熒光響應性最好的ATP1.0。當ATP1.0在HEK293T細胞中表達時，它能夠很好的被運輸到細胞膜上表達，并對細胞外100mM的ATP產生一個~500%的dF/F0峰值。在特異性方面，ATP1.0對細胞外ATP的反應能夠被P2Y1的拮抗劑MRS-2500阻斷。ATP1.0對其它遞質不會產生反應，包括谷氨酸、GABA、甘氨酸、多巴胺、去甲腎上腺素、血清素、組胺和乙酰膽堿等，對二磷酸腺苷（Adenosine Diphosphate, ADP）的反應與ATP類似，但是對于其它結構類似的嘌呤能分子或衍生物，如一磷酸腺苷、腺苷、二磷酸尿核苷等幾乎不產生反應。ATP1.0的反應具有快速動力學的特征，其反應平均上升時間常數約為28 ms，平均衰減時間常數約為283 ms。在熒光強度上，ATP1.0被ATP激活時的亮度達到了直接表達hP2Y1-EGFP融合蛋白熒光強度的64%，并且ATP1.0在單光子激發下的光譜與EGFP相似，激發峰在500 nm，發射峰在520 nm。在與其它細胞外ATP分子探針的比較中，ATP1.0表現出更大的動態檢測范圍、更強的熒光反應、以及更低的信噪比。

 

接下來，研究者探討了ATP1.0在原代培養的星形膠質細胞和神經元中的表達能力以及反應性。ATP1.0能夠廣泛的表達到星形膠質細胞和神經元的細胞上，包括胞體、突起等部位。表達到星形膠質細胞和神經元上的ATP1.0對細胞外ATP均有較好的反應，其平均dF/F0峰值分別約為1000%和780%。此外，ATP誘導的熒光反應也能夠被P2Y1、受體拮抗劑MRS-2500阻斷。此外，與HEK293T中結果相似，神經元中表達的ATP1.0對ATP和ADP均有反應，但對一磷酸腺苷、腺苷、二磷酸尿核苷均無反應。更重要的是，ATP1.0在細胞表面非常穩定，在給予10mM 的ATP 兩小時后，表達ATP1.0的神經元的熒光沒有出現明顯下降。綜上所述，ATP1.0能夠適用于多種類型的細胞，對細胞外的ATP產生高靈敏度、高選擇性和高穩定性的熒光增強反應。

 

2. ATP1.0可用于監測體外培養細胞外的ATP水平

接下來，研究者測試了ATP1.0是否能夠用于檢測神經-膠質共培養細胞中內源性ATP的釋放。在大腦中，機械刺激和細胞腫脹均能誘發胞內ATP被釋放。在表達ATP1.0的細胞中，給予細胞機械刺激（利用玻璃微電極按壓某個細胞），能夠引起一個快速、局部增強的dF/F0信號，反映了ATP的釋放。為了誘導細胞腫脹，研究者將細胞浸泡在低滲溶液（130 mOsm/kg）中;在1min內，dF/F0信號顯著增加。并且在應用MRS-2500后，這兩種刺激引起的反應都被完全抑制。研究者還發現，低滲刺激誘導的ATP釋放可能不需要依賴經典的SNARE囊泡釋放機制，因為細胞表達了破傷風毒素輕鏈（tetanus toxin light chain, TeNT，可以切割突觸短肽并阻止胞外分泌過程），但是對低滲刺激誘導的反應沒有影響；而作為對照，表達TeNT阻斷了低滲刺激誘發的谷氨酸釋放。除了刺激誘發的ATP釋放外，研究者還觀察到，即使在沒有外部刺激的情況下，神經-膠質共培養細胞中也存在自發、局部、以及短暫的ATP1.0信號。在1.6mm2成像視野中，這些自發事件以1.2次/min的速率出現，其dF/F0的平均峰值約為210%。ATP自發釋放的平均上升時間約為11s，衰減時間約為43s，其釋放范圍的平均直徑約為32mm。為了確保ATP1.0信號反映了細胞外的ATP動態變化，研究者利用三磷酸腺苷雙磷酸酶（ATP的水解酶）對細胞進行處理并成像，觀察到三磷酸腺苷雙磷酸酶能夠顯著阻斷自發事件的發生。與以前的檢測手段相比，ATP1.0具備更高的靈敏度，能夠在普通條件下特異性的檢測ATP的釋放。

 

3. ATP1.0可用于監測斑馬魚幼體中ATP的動態變化

在證明了ATP1.0可用于體外ATP的檢測后，研究者接著探討了它是否可以用于監測體內（如斑馬魚中）ATP的動態變化。在斑馬魚幼體神經元中特異性地表達ATP1.0后，利用ATP局部處理會引起視頂蓋中dF/ F0信號出現強烈的瞬時增加，這些信號能夠被MRS-2500阻斷。在驗證了ATP1.0能夠對外源ATP做出反應后，研究者進一步探討了ATP1.0是否能夠用于檢測活斑馬魚內源性ATP的釋放。ATP信號在促進小膠質細胞向損傷部位遷移中發揮關鍵作用。在表達ATP1.0的斑馬魚中，研究者發現激光消融誘導視頂蓋損傷后會導致熒光增強，其反應從損傷部位向外呈放射狀傳播。損傷后11s和64s釋放ATP的范圍，其平均直徑分別為~23mm和~34mm。接下來，研究者通過在斑馬魚的視頂葉中表達ATP1.0，同時監測ATP的釋放和小膠質細胞的遷移，斑馬魚的小膠質細胞用紅色熒光蛋白DsRed標記。研究者們發現，在激光消融后，小膠質細胞沿著ATP傳播路徑逐漸遷移到損傷部位。因此，ATP1.0非常適用于活體斑馬魚幼蟲ATP監測，并且具有較高的時空分辨率。

 

4. ATP1.0可用于監測小鼠全身炎癥引起的ATP局部釋放

ATP是應對機體急慢性炎癥反應的關鍵細胞外信使，但是在全身炎癥期間ATP釋放的模式還不清楚。研究者在小鼠腹腔注射細菌脂多糖（lipopolysaccharides, LPS）誘導全身炎癥，并通過雙光子顯微鏡來觀察直接觀察視覺皮層ATP1.0的熒光反應。注射LPS 24小時后，研究者觀察到皮質內多次ATP局部釋放事件，在記錄的20min內，其發生頻率約為5 – 10次/min。在星形膠質細胞中，ATP釋放的上升時間相對較快（<5s），衰減時間較慢（10-20s）。此外，ATP的釋放具有空間選擇性性，信號的平均直徑（根據每個事件的最大直徑確定）約為9.9mm，小于典型星形膠質細胞的平均直徑（10-20mm）。為了研究ATP釋放與炎癥進展之間的相關性，研究者記錄了注射不同劑量LPS（分別為0.5和10 mg/kg）后不同時間點的皮質ATP釋放情況。研究者發現，在注射LPS后30 min內，ATP釋放均有所增加，且釋放次數隨時間逐漸增加，并分別2h和6h時達到頂峰。對ATP釋放的位置分析顯示，早期ATP釋放發生在相對靠近血管的地方，隨后釋放距離逐漸增加。這些數據表明，大腦可以感知炎癥，并以具有空間選擇性的ATP釋放的形式做出反應，這些結果表明ATP1.0適用于小鼠在體成像，同時兼備高靈敏度和高時空分辨率。

 

總結

該研究報道了一種全新的基因編碼的ATP熒光探針——ATP1.0，該探針能夠高靈敏度地檢測腦組織中ATP的動態變化。ATP1.0可以在多種類型細胞中穩定表達，包括細胞系、星形膠質細胞和神經元，為測量細胞外ATP提供了可靠的工具。此外，利用ATP1.0可以實現體外及在體ATP釋放的可視化實時監測。

 

亮點研究方法

這項工作利用病毒注射、雙光子成像等技術來驗證了ATP1.0在監測細胞外ATP動態變化中的可靠性。瑞沃德深耕神經科學研究領域近20年，一直致力于為客戶提供可信賴的解決方案和服務，可提供這項工作中涉及的病毒注射、光纖記錄以及雙光子成像的完整解決方案。截止目前，瑞沃德產品及服務覆蓋海內外 100 多個國家和地區，客戶涵蓋全球700+醫院，1000+科研院所，6000+高等院校，已助力全球科研人員發表SCI文章12000+，獲得行業廣泛認可。