真菌組是腸道微生物組中不可忽視的成員，在包括炎癥性腸病（IBD）在內的多種疾病中，都發現了腸道真菌組成的變化。然而，真菌組對宿主健康的影響及其作用機制我們仍然知之甚少。2022年3月美國康奈爾大學Iliev教授等人繼于Cell期刊上發表“黏膜真菌通過17型免疫促進腸道屏障功能和社會行為”的研究成果后，再次于Top學術期刊Nature（IF 49.962）上發表題為“Immune regulation by fungal strain diversity in inflammatory bowel disease”的文章，該研究通過對黏膜真菌多樣性測序、培養組學、全基因組測序和免疫反應檢測等實驗，揭示了潰瘍性結腸炎（UC）患者腸道黏膜中優勢真菌-白色念珠菌（Ca）的菌株多樣性及其對宿主腸道免疫調控的機制和菌株特異性，為研究IBD的疾病機理和治療方法提供了新視角。

研究材料

結腸黏膜的灌洗液、C57BL/6J小鼠（SPF、GF）、Ca標準菌株和分離株

技術路線

· 步驟1：真菌多樣性測序發現UC患者的結腸黏膜中Ca豐度明顯增加；

· 步驟2：真菌培養組學結合全基因組測序表明，人腸道Ca具有高菌株多樣性，其對免疫細胞的破壞力以及在小鼠腸道中誘導Th17和促炎免疫的能力具有菌株特異性；

· 步驟3：機制上，高免疫細胞破壞力（HD）的Ca菌株通過分泌念珠菌素（受Efg1-Ece1調控）促進腸道炎癥，且該作用依賴于IL-1β，阻斷其受體IL-1R可在小鼠中減輕疾病；

· 步驟4：患者的Ca菌株誘導免疫細胞損傷和IL-1β表達的能力可反映患者疾病嚴重程度。
 

研究結果

1. 發炎腸道中Ca相對豐度大幅增加

對Non-IBD（n=38）和UC患者（n=40）的結腸黏膜灌洗液樣本進行ITS擴增子測序，結果顯示兩組間真菌組成存在顯著差異（圖1a）。其中，念珠菌屬和酵母菌屬為優勢屬，與Non-IBD組相比，UC患者黏膜富集的真菌群中念珠菌屬增加，而酵母菌屬則顯著減少（圖1b、c）。培養依賴性實驗顯示Ca在UC 患者的黏膜中顯著增加（圖1d）。作者對C57BL/6小鼠進行白色念珠菌SC5314菌株口服灌胃，使用DSS誘導小鼠結腸炎并結合皮質類固醇治療，來研究Ca定植對腸道炎癥的影響。結果顯示對照組小鼠僅發展為輕度疾病，但Ca定殖的小鼠表現出增強的組織病理學，包括結腸中黏膜糜爛、隱窩破壞和炎癥細胞浸潤增加，以及CD4⁺ T細胞和中性粒細胞浸潤增加（圖1e-h）。這些結果表明共生的Ca對皮質類固醇治療下的疾病結果產生負面影響。

圖1 Ca在UC患者的結腸粘膜中擴張，并在小鼠結腸炎模型中促進炎癥

 

2. Ca菌株特征影響腸道免疫

腸巨噬細胞是啟動和誘導結腸粘膜抗真菌免疫的關鍵，強毒性Ca菌株則可以損傷這些細胞，而Ca的菌絲形態發生程序是在幾種粘膜表面產生毒力因子和發病機制的關鍵。培養組學實驗結果顯示腸道Ca分離株可分為兩大類：高損傷 (HD-Ca) 和低損傷分離株（LD-Ca），~60%的分離株無論宿主疾病狀態如何都形成細絲，且形成細絲的Ca菌株對巨噬細胞的損傷更大（圖2a、b）。這些結果表明Ca菌株損傷免疫細胞的能力與成絲能力相關。通過無菌小鼠Ca定植模型評估Ca分離株的免疫反應，結果顯示促炎反應與Ca載荷無關，相較于LD-Ca，HD-Ca在結腸中誘導強烈的促炎反應，包括中性粒細胞浸潤和Th17細胞誘導（圖2d-f），并且加重結腸炎小鼠模型的腸道炎癥（圖 2h-i ）。因此，特定的人類腸道衍生的Ca分離株誘導Th17細胞和促炎免疫的顯著能力是菌株依賴性的，并且與它們造成巨噬細胞損傷的能力直接相關。

圖2 腸源性Ca誘導的細胞損傷和促炎免疫是菌株依賴性的

 

3. 念珠菌素促進腸道炎癥

轉錄因子增強絲狀生長蛋白1 (Efg1) 及其相關途徑與Ca共生性相關。基于CRISPR-Cas9技術敲除HD菌株EFG1基因后，Ca在腸粘膜過度生長，但其絲狀化和細胞損傷能力降低，并導致小鼠結腸中Th17細胞積累顯著減少（圖3a-d），且兩類Ca分離株菌絲粘附/穿透進入腸上皮細胞間無明顯差異（圖3e）。這些結果表明特定的真菌因子（而非單獨的菌絲形態）是導致腸道免疫激活表型的原因。ECE1是編碼念珠菌素（菌絲相關毒力因子）的基因，主要受EFG1調控。敲除ECE1基因導致細胞損傷、小鼠結腸中Th17細胞募集和促炎免疫持續減少（圖3f-h）。這些結果表明，Ca介導的Th17細胞和促炎性腸免疫是菌株依賴性的，并且HD菌株中依賴Efg1調節的念珠菌素在這一過程中起關鍵作用。

圖3 HD Ca通過Efg1-Ece1依賴因子念珠菌素促進腸道促炎免疫

 

4. Ca菌株誘導的IL-1β反映了UC的嚴重程度

對Ca分離株進行全基因組測序，18個分離株位于不同的進化樹分枝，表明Ca菌株具有高度遺傳多樣性。研究發現，IL-1β與特定腸道Ca菌株造成免疫細胞損傷的能力密切相關，Ca菌株誘導巨噬細胞損傷的能力、IL-1β（而非Ca相對豐度）與個體UC患者的疾病嚴重程度之間存在很強的正相關性（圖 4b-e）。這些結果表明菌株的功能特征，而不是真菌組成，能夠反映患者的疾病嚴重程度。IL-1R阻斷顯著減少了HD-Ca定植小鼠的中性粒細胞募集、Th17細胞積累和結腸炎癥（圖4g-j），這些數據表明IL-1信號通路在Ca誘導的結腸促炎免疫細胞積累中起關鍵作用。

圖4 患者特異性Ca菌株誘導IL-1β的能力反映了UC疾病的嚴重程度，抗IL-1R抗體治療可改善小鼠疾病
 

小編小結

本研究開發了一個轉化平臺，用于在真菌菌株和患者特定水平上對真菌生物群進行功能分析。該平臺結合了高分辨率真菌生物群測序、真菌培養組學和基因組學、基于CRISPR-Cas9的真菌菌株編輯系統、體外功能性免疫反應性測定和體內模型，能夠檢查人類腸道中的宿主-真菌間crosstalk。本文發現機會性Ca菌株具有豐富的遺傳多樣性，這些菌株在炎癥性腸病患者的結腸粘膜中占主導地位。人腸道來源的Ca分離株中，具有高免疫細胞損傷能力的菌株反映了UC個體患者的疾病特征，并通過IL-1β依賴性機制在體內加重了腸道炎癥。從良性共生到致病狀態的轉變過程中，HD菌株對利基特異性炎癥免疫和產IL-17A的Th17細胞的抗真菌反應依賴于Ca分泌的念珠菌素。這些發現揭示了人類腸道中宿主-真菌相互作用的菌株特異性，并突出了炎癥性疾病新的診斷和治療靶點。
 

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腸-免疫-靶軸系統研究方案

· 16s/宏基因組----腸道微生物的組成及改變

· 免疫代謝組----腸道微生物產生的用于調控機體免疫的代謝物

· 免疫因子組----腸道微生物如何影響機體免疫

· 轉錄/蛋白質組----對終端靶器官應對炎癥響應機制的系統描述