蛋白質翻譯后修飾(PTMs)是植物對環境變化反應最快、最早的一種響應方式，其機制和動力學研究是植物科學的一個非常重要的領域。其中目前研究最多的PTM之一是磷酸化修飾。Mut9樣激酶（MLKs）是植物特異性核定位激酶家族，可磷酸化多種晝夜節律和光信號通路相相關的蛋白從而調控植物的生長發育。但目前對MLK激酶家族調控的各種信號通路和蛋白網絡的理解較少。

2021年，Molecular & Cellular Proteomics (IF 5.911)在線發表了一篇題為“Quantitative Proteomics and Phosphoproteomics Support a Role for Mut9-Like Kinases in Multiple Metabolic and Signaling Pathways in Arabidopsis”的文章，該文章利用蛋白組學和磷酸化蛋白組學發現了MLKs的缺失會改變硫代葡萄糖苷酶的豐度和代謝、增加植物對紫外線輻射和DNA損傷劑的敏感性，從而確定了這些激酶在調節植物次生代謝和應激反應中的新作用。

研究材料

擬南芥WT和mlk突變（mlk1/2/3及mlk1/3/4）幼苗
 

技術路線

· 步驟1：mlk突變體幼苗的蛋白質組學分析；

· 步驟2：mlk突變體幼苗的磷酸化修飾質組學的分析；

· 步驟3：顯著差異磷酸化蛋白的motif分析；

· 步驟4：顯著差異磷酸化蛋白的GO分析；

· 步驟5：mlk突變增加了植物對DNA損傷的敏感性。

研究結果

1. mlk突變體幼苗的蛋白質組學分析

作者利用TMT蛋白組學技術，分析WT、mlk突變（mlk1/2/3及mlk1/3/4）擬南芥幼苗中MLKs對蛋白質組動力學的調控作用（圖1）。WT和mlk突變擬南芥幼苗分別在光照和黑暗條件下放置12 h，在關燈前(ZT12)和黑暗2小時后(ZT14)分別進行采樣。

蛋白組學共鑒定到近50000個肽對應7500個蛋白，差異分析顯示在兩個時間點上，mlk1/2/3突變株（較于WT）中僅13個顯著差異蛋白，mlk1/3/4突變株的顯著差異蛋白數為110個（圖2），結果表明mlk1/ 3/4突變對整體蛋白質組的影響大于mlk1/2/3突變。差異蛋白的GO分析結果表明mlk1/2/3 ZT12、mlk1/3/4 ZT12、mlk1/3/4 ZT14組的上調蛋白主要富集在GLS（硫代葡萄糖苷）生物合成和相關過程上，下調蛋白主要富集在GLS分解代謝過程中（圖3）。

為了驗證MLKs參與GLS代謝調節，作者在ZT12時定量分析GLS的水平峰值，結果表明在mlk1/2/3和mlk1/3/4突變體幼苗（與野生型相比）中，脂肪族GLSs的含量均有所增加且與GLS相關生物合成酶的豐度增加有關（圖4）。

圖1 TMT蛋白組學流程


圖2 蛋白組學顯著差異分析


圖3 顯著差異蛋白的GO分析

圖4 mlk突變株幼苗含有較高水平的（met衍生的）硫代葡萄糖苷

2. mlk突變體幼苗的磷酸化修飾質組學的分析

作者采用TMT磷酸化的方式對WT和mlk突變體幼苗進行磷酸化組學分析，總共鑒定到23386個磷酸化位點（對應15222個肽段），修飾位點所在的氨基酸分布均以Ser居多（圖5A）。差異比較分析結果顯示相較于WT組，mlk1/3/4 ZT12、mlk1/3/4 ZT14的顯著差異磷酸化肽段數分別均比mlk1/2/3 ZT12、mlk1/2/3 ZT14的多，由此證明在兩個時間點上尤其是在Z12時，mlk1/3/4突變體對磷酸化蛋白組的影響大于mlk1/2/3突變體（圖5B）。這一結果證明了mlk是以光依賴的方式調節磷酸化蛋白質組。

對兩個時間點的差異蛋白的共有蛋白進行分析（圖5C和5D），結果顯示它們主要參與了基因沉默和染色質結構通路，但部分參與染色質結構的蛋白僅在兩種突變體的ZT12時間點上發生了顯著改變，由此說明MLKs參與調控基因表達，且可能通過調節光依賴的染色質結構。

圖5 mlk突變體幼苗的磷酸化蛋白組學分析

3. 顯著差異磷酸化蛋白的motif分析

顯著差異的磷酸化肽段進行motif分析，結果顯示顯著上調、下調的磷酸化肽段分別展示出多種不同的motif基序（圖6A和6B），這些基序均與一些特定的激酶相關。這些基序的多樣性，表明MLK家族激酶通過系統調控多種激酶信號網絡影響了許多生物過程。

圖6 顯著差異磷酸化肽段的motif分析
 

4. 顯著差異磷酸化蛋白的GO分析

對mlk兩種突變體在ZT12和ZT14的顯著差異磷酸化蛋白的GO富集分析，發現在細胞成分（cc）類別中，與細胞核相關的條目均高度富集（圖7A），結果表明MLKs主要定位在細胞核中。在生物過程（bp）類別中，與染色質修飾相關的通路及蛋白均被富集（圖7B和7C），結果表明MLKs在染色質結果中發揮作用。

對mlk1/3/4 ZT12突變幼苗的顯著差異磷酸化蛋白的GO富集分析發現主要分布在節律過程和/或晝夜節律的過程中，證明了mlk與光信號和晝夜節律調節有相關性。

圖7 顯著差異磷酸化蛋白的GO 分析
 

5. mlk突變增加了植物對DNA損傷的敏感性

由于ZT12時間點上的mlk1/3/4的缺失對整體蛋白組和磷酸化修飾組的影響最大，因此，作者針對mlk1/3/4 ZT12數據集中顯著上調、顯著下調的磷酸化蛋白分別做GO分析（圖8）。結果發現下調蛋白的富集生物過程中包含細胞對DNA損傷刺激的反應條目。為進一步驗證MLKs在DNA損傷反應中的作用，作者評估了突變體和WT幼苗對基因毒性試劑MMS和UV-C的敏感性。結果表明隨著MMS水平的增加，幼苗重量逐漸減少、褪綠組織增多、生長發育受損，相較于WT組，突變體的敏感性更高（圖9A-9D），暴露于多劑量UV-C輻照時，mlk突變體對紫外線誘導的DNA損傷也更敏感（圖9E）。綜上所述mlk突變體增加了對DNA損傷的敏感性。

圖8 mlk1/3/4 ZT12顯著差異磷酸化蛋白的GO分析


圖9 mlk突變體對DNA損傷的敏感性
 

小編小結

在這項研究中，作者對WT和mlk突變體幼苗在兩個不同時間點進行了深入的蛋白質組和磷酸化修飾蛋白組學的定量分析。結果顯示MLK突變幼苗改變了硫代葡萄糖苷(GLS)代謝酶的豐度，以及參與一系列不同生物過程(包括RNA加工、染色質組織)的蛋白質磷酸化差異。此外，mlk也可能調控擬南芥的DNA損傷反應。

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