快速、高通量的病毒中和抗體的檢測方法
簡介
新冠病毒的出現導致了世界范圍內的新冠大流行，為了理解病毒的發病機理并開發疫苗，亟需快速開發多種研究工具。檢測病毒感染和疫苗接種后的免疫反應對新冠病毒的研究十分重要。由于中和抗體是免疫反應和疫苗效價的關鍵生物標志物，患者血清樣本中的中和性抗體水平是用于監測有效性的重要參數。
人體血清中和抗體的鑒定常使用傳統方法例如蝕斑減少中和試驗 (PRNT) 來檢測。然而，該方法使用活的、具備感染性的病毒加入到靶細胞中，所以需要生物安全三級實驗室以及耗時費力的細胞培養。數據結果的分析耗費時間并且不能自動化。此外，假病毒中和試驗 (pVNT) 方法使用改良型的病毒，可以在生物安全二級實驗室完成，但此方法需要細胞培養和熒光成像來測得中和抗體活性，因此，也不適用于樣品的高通量篩選。
此 GeneScript cPass 新冠病毒中和抗體檢測試劑盒采用免病毒中和測試法 (sVNT) 來克服傳統的病毒中和實驗的缺點。它采用酶聯免疫吸附試驗 (ELISA) 的模式，如圖 1 和圖 2 所示。
優點
優點
•快速、簡單的 ELISA 實驗流程設置
•無需三級實驗室或細胞培養
•實驗結果與蝕斑減少中和試驗數據一致
刺突蛋白受體結合區域的 HRP 偶聯片段與含有中和性抗體的患者血清樣本相結合。此混合物加入到已被 ACE2 受體包被的 ELISA 孔板中。如果樣品中的抗體有中和抗體的活性，那么 HRP-RBD 同 ACE2 的 結合將會被打破，隨后清洗，移除HRP-RBD。使用光吸收微孔板讀板機測量產生的信號，在中和抗體存在的情況下，此信號會更低，將此信號與實驗對照組的信號進行比較，可以評估待測樣本中存在的中和抗體活性。
在此替代的病毒中和實驗 (sVNT) 試 劑盒的數據結果，由SpectraMax 微孔 板讀 板機 進 行檢 測、SoftMax Pro 軟件進行分析得到。這些結果與先前使用的傳統假病毒中和試驗(pVNT) 方法得到的結果密切相關，然而只需要一小部分地時間和更低的生物實驗室安全等級限制。
圖 1 對比 PRNT 和 sVNT 試劑盒的操作流程。sVNT 實驗方法能在二級實驗室中 1 小時內完成，而 PRNT 需要活的新冠病毒以及繁瑣的細胞培養技術，在三級實驗室中也要兩天多的時間。
圖 2 新冠病毒 sVNT 檢測方法。此實驗使用 ELISA 模式，在待測樣本中通過中和性的抗體能夠檢測 RBD 與 ACE2 結合的擾動。
材料
• GenScript cPass 新冠病毒中和抗體檢測試劑盒 (GenScript cat. #L00847-A)，
• 10 份血清樣本，已經通過 PRNT (Corgenix) 方法證實中和抗 體陽性，
• 3 份血清樣本，已經通過 PRNT (Corgenix) 方法證實中和抗體陰性，
• MultiWash+ 微孔板洗板機 (Molecular Devices)
• 光吸收檢測模式用到的 Molecular Devices 酶標儀：
• SpectraMax ABS Plus 酶標儀
• SpectraMax iD5 多功能酶標儀
• SpectraMax i3x 多功能酶標儀
• SpectraMax M5e 多功能酶標儀
在實驗開始前，試劑盒的所有組分和待測樣本可放置于室溫。試劑盒中的試劑需要按如下操作稀釋：
• 用去離子水稀釋 20x 儲液得到 1x wash，
• 用 HRP 稀釋緩沖液按 1:1000 比例稀釋 HRP-RBD 儲液得到HRP-RBD 工作液。
待測樣本 和實驗對照組分別與 HRP 偶聯的 RBD 混合，并按如下操作孵育。待測樣本、陽性對照、陰性對照，分別用樣品稀釋緩沖液按 1:10 比例稀釋，例如：12uL 待測樣品 + 108uL緩沖液。將稀釋后的樣品和對照組分別與等量的 HRP-RBD 工作液混合在不同的試管中，例如：120uL HRP-RBD 工作液 +
待測樣本 和實驗對照組分別與 HRP 偶聯的 RBD 混合，并按如下操作孵育。待測樣本、陽性對照、陰性對照，分別用樣品稀釋緩沖液按 1:10 比例稀釋，例如：12uL 待測樣品 + 108uL緩沖液。將稀釋后的樣品和對照組分別與等量的 HRP-RBD 工作液混合在不同的試管中，例如：120uL HRP-RBD 工作液 +
120uL 稀釋后的待測樣品或對照品。此混合物在 37 度孵育15 分鐘。
分別添加 100uL 的陽性對照混合物、陰性對照混合物、待測樣品混合物至實驗復孔中。然后封蓋，在 37 度孵育 15 分鐘。
使 用 MultiWash+ 洗 板機 和 1x wash 溶 液 清 洗 所有 的 微 孔板，每次每孔 300 uL，橫向吸液。然后，100uL TMB 溶液加入到每個孔中，封蓋，避光，室溫孵育 15 分鐘。
與 TMB 底物孵育后，50 uL 終止溶液加入到每個孔中，立即在多款酶標儀上測讀，光吸收波長設置為 450 nm。實驗結果的有效性評估看陰性對照的 OD450 值是否大于 1.0，陽性對照的值是否小于 0.3。如果不符合這些標準，實驗結果無效，需要重復試驗。各個待測樣本的百分比抑制值按如下公式計算：
表 1 的卡值被用來說明樣本的結果是陽性還是陰性，是否存在可檢測到的新冠中和抗體。表中的卡值來源于新冠 sVNT試劑盒手冊。對于不同地區和種族背景，使用者可以直接基于具有代表性的患者血清樣本設置卡
表 1 抑制性卡值大小用于說明實驗結果。
結果
使用陽性和陰性對照評估實驗結果的質量。如表 2 所示，陰性對照的 OD450 值大于 1.0，陽性對照的 OD450 值小于 0.3，這是根據 sVNT 試劑盒的質量控制要求而定。
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表 2，陰性對照的 OD450 值大于 1.0，陽性對照的 OD450 值小于 0.3，驗證了實驗結果。對照組做一次重復實驗，變異系數 CV 值小于 30% 是可重現的。
如方法中所描述，待測樣本和陰性對照的 OD450 值用于計算百分比抑制值。基于試劑盒手冊中一般的卡值特點，百分比抑制值大于等于 30% 說明檢測到新冠中和抗體，呈陽性；百分比抑制值小于 30% 說明未檢測到新冠中和抗體，呈陰性。在PRNT 中和活性檢測中呈陰性的三個樣品，在 sVNT 檢測中也呈陰性。同樣地，在 PRNT 中和活性檢測中呈陽性的十個樣品，在 sVNT 檢測中也呈陽性 ( 如表 3)。
結論
表 3 先前測得的多個樣品的百分比抑制值和陽性、陰性結果。使用SpectraMax ABS Plus 獲得表中所示的實驗結果，其他類型的酶標儀也獲得相同的結果。
結論
此 GenScript cPass 新冠病毒中和抗體檢測試劑盒數據來源于一組患者血清樣本，與傳統的、耗時費力的 PRNT 方法獲得的數據吻合。此 sVNT 試劑盒提供了易于使用的試劑和緊湊的 ELISA 工作流程，大約 1 小時能夠完成。其中必需的一步清洗操作由MultiWash+ 洗板機完成，節約了寶貴的時間。SpectraMax 讀板機和 SoftMax Pro 軟件產生的數據能夠運用實驗特異的方案進行分析，設置公式可以應用于所需的計算和自動結果輸出。
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參考文獻
1. Lau EHY, Tsang OTY, Hui DSC, Kwan MYW, Chan W, Chiu SS, Ko RLW, Chan KH, Cheng SMS, Perera RAPM, Cowling BJ,
Poon LLM, and Peiris M. Neutralizing antibody titres in SARS-CoV-2 infections. Nature Communications 12:63 (2021).
2. Sahin U, Muik A […] and Tureci O. COVID-19 vaccine BNT162b1 elicits human antibody and TH1 T cell responses.
Nature 586, 594–599 (2020).
3. SARS-CoV-2 surrogate Virus Neutralization Test (sVNT) Kit Manual (cat. #L00847).
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