一、實驗目的

　　1.掌握酵母細胞的培養方法

　　2.學會使用相差和微分干涉顯微鏡

　　二、異源互補技術概述

　　釀酒(芽殖)酵母的培養在許多方面可以與大腸桿菌相比較。這種酵母可以用標準的微生物學技術在液體和固體培養基中進行培養。大多數酵母菌株在復合液體培養基中的倍增時間為90～120min，到靜止期時細胞滴度為3×108到5×108細胞/mL。單個細胞在復合固體培養基上經過36hr可長成1～2mm的單菌落，在合成的有限培養基中生長較慢，倍增時間至少增加為原來的兩倍，且細胞的最終滴度僅達到2×107到3×107細胞/mL。在有限培養基平板上菌落需大約60hr才能長成容易計數的大小。在復合或有限培養基上生長的菌落能影印培養或轉移到膜上，進行分子水平的分析。

　　非洲粟酒裂殖酵母和其近親釀酒酵母一樣，是一種子囊真菌，但它與發芽酵母的關系并不密切，兩種酵母的蛋白質序列和基因同源性在60﹪到90﹪。與釀酒酵母相比，非洲粟酒裂殖酵母通常是單倍體細胞，可分為兩種交配型，在饑餓情況下不同的交配型單倍體進行交配，形成雜合的雙倍體合子。雙倍體合子經過減數分裂形成4個孢子，由孢子發芽而長成單倍體菌落。非洲粟酒裂殖酵母具有典型的真核生物的細胞周期，包括G1、S、G2和M四個時期。在基本或復合培養基中其世代時間為2到4個h，其中G2期占細胞周期的70﹪，其它期各占10﹪。

　　三、材料、試劑和儀器

　　1.材料

　　釀酒芽殖酵母(Saccharomycescerevisiae)和非洲粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyceskephir)。

　　2.試劑

　　1)釀酒芽殖酵母的培養基

　　(1)YPD(YPED)液體培養基(用于酵母菌搖培，100mL)

　　細菌培養用蛋白胨(Bacto-peptone)2g

　　細菌培養用酵母提取物(Bacto-Yeastextract)1g

　　葡萄糖(Glucose，配成40%detrose貯液單獨滅菌,4℃保存)2g

　　加ddH2O至90mL，調pH值至4-5，定容至95mL，高溫滅菌(121℃,15min)。待溫度降至55℃時，加入5mL預熱(至少室溫放置30min)無菌的40%detrose貯液。

　　(2)YPD(YPED)固體培養基(可用于保菌或培養，100mL)

　　在YPD液體培養基的營養物中加入2g瓊脂粉，加ddH2O至90mL，調pH值至5.8，定容至95mL，高溫滅菌(121℃,15min)。待溫度降至55℃時，加入5mL預熱(至少室溫放置30min)無菌的40%detrose貯液。

　　(3)YPAD(斜面)培養基(可用于保菌或培養營養缺陷菌株，100mL)

　　在YPD液體培養基中加入硫酸腺嘌呤(Adeninehemisulfatesalt，腺嘌呤半硫酸鹽)40mg，瓊脂(Bacto-agar)(液體培養基不加)2g。加ddH2O至90mL，調pH值至5.8(液體調至4左右)，定容至95mL，高溫滅菌(121℃,15min)。待溫度降至55℃時，加入5mL預熱(至少室溫放置30min)無菌的40%detrose貯液。分裝培養基，傾斜放置形成斜面，每支試管依大小可加入3-5mL培養基。(若葡萄糖直接加入培養基則可先分裝至試管后滅菌(需要棉塞)，滅菌會造成葡萄糖碳化，培養基略變褐色，對酵母培養會略有影響)。該培養基用于4-6個月的短暫保菌或酵母培養。

　　2)非洲粟酒裂殖酵母的培養基

　　(1)YE培養基(100mL)

　　酵母提取物0.5g

　　葡萄糖(Glucose，配成40%detrose貯液單獨滅菌，4℃保存)2g

　　細菌培養用瓊脂(Bacto-agar)2g

　　加ddH2O至90mL，調pH值至5-6，定容至95mL，高溫滅菌(121℃,15min)。待溫度降至55℃時，加入5mL預熱(至少室溫放置30min)無菌的40%detrose貯液。

　　(2)YEA培養基(100mL)

　　YEA配方中含有150mg/L的腺嘌呤。用于培養尿嘧啶缺陷株的培養基，應加入150mg/L的尿嘧啶以利于最佳生長。

　　3.儀器

　　恒溫培養箱，恒溫搖床，相差/微分干涉顯微鏡，普通光學顯微鏡

　　四、實驗程序

　　1.酵母菌的搖培無菌條件下，用接種環或微量取樣器將酵母菌菌種接種于YPD液體培養基和非洲粟酒裂殖酵母的培養基，28-30℃,200rpm恒溫搖床搖培過夜。

　　2.制片、壓片，明視野顯微觀察。

　　3.相差顯微鏡的使用與標本觀察。

　　4.液體培養基中細胞滴度的檢測

　　5.分光光度測定法

　　1)YPAD過夜培養物用水稀釋100倍。

　　2)用分光光度計測定600nm處的光密度。

　　3)記住稀釋倍數，計算原始培養物的細胞數。

　　例如：在YPAD中100倍稀釋的培養物的OD600為0.21，可按下式計算：

　　0.21(OD600)×100(稀釋倍數)×1×106(個細胞/mL)/0.1(OD600)=2.1×108個細胞/mL

　　對于OD600和細胞滴度之間的對應關系應分別測定，可通過將特定OD600的培養物稀釋后涂板檢測每毫升的活細胞數。

　　6.血細胞計數器計數法

　　1)YPAD過夜培養物用水稀釋10倍。

　　2)將細胞懸液小心地加在蓋片和血細胞計數器之間。10×物鏡和10×目鏡觀察，相差顯微鏡觀察效果更好。讓細胞在血細胞計數器的網格中停留幾分鐘。網格區為1mm2，分成25個相同大小的方格，其容積為10-4mL。

　　3)計數5個對角方格中的細胞數量，乘以5即是整個網格區細胞的總數。

　　4)計算細胞滴度：計數的細胞數×5×稀釋倍數×1/血細胞計數器25個方格的容積。

　　例如：5個對角方格中計數的細胞為239個，其滴度計算應是：

　　239個細胞×5×10(稀釋倍數)×1/10-4mL=1.2×108個細胞/mL