質粒的分類和提取的主要步驟及作用
瀏覽次數:1291 發布日期:2022-3-31
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分類:
1.根據質粒能否通過細菌的接合作用,可分為接合性質粒和非接合性質粒。接合性質粒帶有與接合傳遞有關的基因。非接合質粒在一定條件下通過與其共存的接合質粒的誘動或轉導而傳遞。
2.根據質粒在細菌內的復制類型可分為兩類:嚴緊控制型和松弛控制型。
嚴緊控制復制型質粒的復制酶系與染色體DNA復制共用,只能在細胞周期的一定階段進行復制,當細胞染色體停止復制時,質粒也就不再復制。松弛控制復制型的質粒的復制酶系不受染色體DNA復制酶系的影響,在整個細胞生長周期中隨時都可以復制,在染色體復制已經停止時質粒仍能繼續復制。
3.根據質粒的不相容性,可分為不相容性和相容性。不相容性指結構相似、密切相關的質粒不能穩定地共存于同一宿主細菌內的現象,反之為相容性。常用于流行病學的調查。
功能:
質粒具有自主復制能力,使其在子代細胞中也能保持恒定的拷貝數,并表達所攜帶的遺傳信息。細菌質粒是DNA重組技術中常用的載體。載體是指把一個有用的外源基因通過基因工程手段,送進受體細胞中去進行增殖和表達的工具。將某種目標基因片段重組到質粒中,構成重組基因或重組體。然后將這種重組體經微生物學的轉化技術,轉入受體細胞(如大腸桿菌)中,使重組體中的目標基因在受體菌中得以繁殖或表達,從而改變寄主細胞原有的性狀或產生新的物質。
從細菌中分離質粒DNA的方法都包括3個基本步驟:
培養細菌使質粒擴增;收集和裂解細胞;分離和純化質粒DNA。
采用強堿液、加熱或溶菌酶(主要針對革蘭氏陽性細菌)可以破壞菌體細胞壁,十二烷基磺酸鈉(SDS)和TritonX-100(一般很少使用)可使細胞膜裂解。
經溶菌酶和SDS或TritonX-100處理后,細菌染色體DNA會纏繞附著在細胞碎片上,同時由于細菌染色體DNA比質粒大得多,易受機械力和核酸酶等的作用而被切斷成不同大小的線性片段。當用強熱或酸、堿處理時,細菌的線性染色體DNA變性,而共價閉合環狀DNA(CovalentlyclosedcircularDNA,簡稱cccDNA)的兩條鏈不會相互分開,當外界條件恢復正常時,線狀染色體DNA片段難以復性,而是與變性的蛋白質和細胞碎片纏繞在一起,而質粒DNA雙鏈又恢復原狀,重新形成天然的超螺旋分子,并以溶解狀態存在于液相中。
在細菌細胞內,共價閉環質粒以超螺旋形式存在。在提取質粒過程中,除了超螺旋DNA外,還會產生其它形式的質粒DNA。如果質粒DNA兩條鏈中有一條鏈發生一處或多處斷裂,分子就能旋轉而消除鏈的張力,形成松弛型的環狀分子,稱開環DNA(OpencircularDNA,簡稱ocDNA);如果質粒DNA的兩條鏈在同一處斷裂,則形成線狀DNA(LinearDNA)。當提取的質粒DNA電泳時,同一質粒DNA其超螺旋形式的泳動速度要比開環和線狀分子的泳動速度快。