蛋白質是細胞的功能分子，基因功能的執行者，從核糖體剛翻譯出來的蛋白質是沒有功能的，需要到達細胞的指定位置（胞內、胞外，和不同的亞細胞器等）并形成特定的空間結構，才能發揮其功能作用。翻譯過程會發生不同類型以及水平的蛋白質翻譯后修飾（PTMs; 在UniProt數據庫中報告了400種以上翻譯后修飾種類，真核生物中有326種，細菌中有250種，古生菌中有80種）。PTM在幾乎所有細胞過程中都起著至關重要的作用，包括細胞周期、降解、凋亡、細胞信號傳導、轉錄等（圖1）。
 

圖1. 翻譯后修飾（PTM）種類

既然蛋白修飾扮演者如此重要的角色，那小編就跟大家說道說道了，這次咱先從最常見的磷酸化修飾說起吧。

技術簡介
蛋白質磷酸化(Phosphorylation)是由蛋白質激酶催化的把ATP的磷酸基轉移到底物蛋白質氨基酸殘基（Ser、Thr、Tyr）上的過程，或者在信號作用下結合GTP，是生物體內一種普通的調節方式，細胞內有超過30%的蛋白質發生磷酸化修飾，在細胞信號轉導、調控細胞增殖、發育、分化、凋亡過程中起重要作用。磷酸化通常比其他翻譯后修飾受到更大的關注，部分原因是激酶在疾病，尤其是癌癥中經常過表達或突變。因此，許多抑制劑和抗體被開發出來對抗激酶的活性。

磷酸化由激酶催化，去磷酸化由磷酸酶作用執行，如圖2所示：

圖2. 蛋白磷酸化與去磷酸化過程

如此重要的修飾過程，我們如何去更好的進行相關研究呢？

研究方法
磷酸化蛋白質組學是主要的研究手段， 質譜法是鑒別蛋白磷酸化位點和定量磷酸化變化的關鍵工具。磷酸化肽段的富集對于成功的磷酸肽MS 分析至關重要。目前富集方法包括TiO2富集方法、抗磷酸酪氨酸抗體、固定化金屬親和層析（IMAC）、化學修飾和強陽離子交換層析（SCX）等。

如圖3展示了磷酸化肽段的傳統富集方法，它們各有什么優缺點呢？

1、高親和力的IP抗體可以識別不同氨基酸的磷酸化位點，但每種抗體都對周圍的氨基酸有一定的偏向性，因此使用多種抗體進行IP會增加磷酸蛋白質組的覆蓋率。

2、二氧化鈦（TiO2）制備時間更短，并提供更大的容量。由于該方法利用了與IMAC相同的原理，因此它同樣容易非特異性保留酸性非磷酸化肽。

3、IMAC富集方法是基于磷酸基團對Fe3+Zn2+和Ga3+等金屬離子的高親和力。主要局限性在于非磷酸化酸性肽的非特異性保留，將羧酸基團轉化為酯可有效消除非磷酸化肽在IMAC柱上的非特異性保留。該方法能夠在較低的響應范圍內檢測磷酸肽。由于不同的金屬離子對不同的磷酸化肽亞群富集效率不同，因此可通過對不同金屬的多次分析，或通過在單個IMAC富集步驟中混合多種金屬離子，獲得磷酸蛋白質組的最大覆蓋率。

圖3. 磷酸化肽段富集方法

最重要的磷酸化肽富集工作完成之后，就可以準備上機檢測啦，質譜檢測的方法也是多種多樣：

1.Label free方法：無需標記，不限樣本適量，母離子峰強度定量；

2.TMT方法：MS2定量準確度高，二級色譜分餾深度檢測；

3.DIA方法：MS2定量準確度高，重復性大幅度提高，更少缺失值。

如何選擇，那就看檢測的樣本數量以及蛋白含量，樣本平行性等等因素啦~

技術應用
最后要跟大家聊的是，修飾組學與其他組學如何搭檔，實現數據的升華呢？

修飾組學+常規蛋白組
最常見的是修飾組學與常規蛋白組聯合分析，因為從單一組學層面去分析僅能得到一個分子層面的數據，不能說明具體變化的主角是整個蛋白水平還是修飾水平，因此兩個組學的聯合分析對于系統深入的分子機制研究是至關重要的。

案例：機體晝夜節律調節因子的新發現

PMID:32054765 Science 20200214;367(6479)

晝夜節律(約24小時)在調節日常生理方面起著重要作用。轉錄因子Bmal1是哺乳動物生物鐘的主要驅動因子，是作為機體主要的分子計數器的關鍵部分。美國賓夕法尼亞大學Akhilesh B. Reddy發現，通過深度TMT蛋白組、磷酸化蛋白組和轉錄組學研究［4］，在Bmal1基因敲除小鼠中，即使沒有外界刺激(如光或溫度的變化)，其也會影響身體的周期變化，預示著生物時鐘的其他驅動因素也是存在的。
 

修飾蛋白組+其他組學

它們兩個搭檔，可以講述出更加精彩的故事，比如修飾蛋白組與轉錄組學聯合分析，逐步揭開生命活動機理的神秘面紗：

案例：BET抑制可阻斷炎癥誘導的心功能不全和SARS-CoV-2感染

PMID: 33811809 Cell 20210415;184(8)

COVID-19冠狀病毒疾病患者發生心臟損傷和功能障礙，并增加死亡率。病因尚不明確，但可能是直接的心臟感染和/或炎癥引起的功能障礙。為了確定機制和心臟保護藥物，作者應用磷酸蛋白質組學和單核RNA測序技術進行研究，最終確定干擾素γ、白細胞介素1β和聚 (I:C)的聯合作用誘導心臟舒張功能障礙。
 

1.方法優化升級，更高深度數據檢測，修飾位點鑒定數量大幅度提升；

2.強大的研發團隊，多年質譜經驗積累，穩居行業領先水平；

3.全方位服務，多角度售后，協助文章發表。

哈哈，老師們現在是不是已經摩拳擦掌，躍躍欲試了呢，樣本可以準備起來啦，期待與您的合作~