iQue® 高通量流式細胞儀通過高通量懸浮細胞篩選填補了這一空白。具備多通道、多參數的特點，可以快速、輕松地篩選 96、384或 1536 孔板的大型文庫。通過ForeCyt®高通量分析軟件自動生成豐富、海量的數據集，快速確定化合物的優先級，加快推進藥物發現流程。下面通過5大應用，一覽iQue®在小分子藥物研發中的風采吧！

小分子藥物發現

1    急性髓系白血病治療藥物開發

盡管60%-70%的急性髓系白血病（AML）患者在接受標準誘導治療后病情得到緩解，但大多數患者會在三年內復發，五年的總生存率只有27%。因此，尋找新的AML治療策略是一種亟待滿足的醫療需求。近期的三項研究中都將iQue®整合到AML潛在治療藥物篩選的工作流程中。

蒙特利爾大學免疫學和癌癥研究所（IRIC）的科研人員發現Mubritinib（一種ERBB2抑制劑）具有很強的在體外和體內抗AML的活性，可通過抑制泛醌依賴性電子傳遞鏈（ETC）復合物I的活性而發揮作用[1]。赫爾辛基大學分子醫學研究院的科研人員通過iQue®，同時對34個原始AML樣本中不同細胞群對7種藥物，及27種組合劑量的體外敏感度進行了評估（圖1-1）。結果表明，AML樣本中的不同細胞群對靶向治療藥物的敏感度存在差異 ^[2]。

圖1-1. 實驗設置簡要流程示意圖

隨后，他們使用iQue®建立了一種高通量流式細胞術，同時監測71種抗腫瘤化合物對多個造血細胞群（表面抗原表達）的劑量反應。通過對比健康細胞和腫瘤細胞（來自AML、多發性骨髓瘤或慢性淋巴細胞白血病患者）的藥物反應，發現健康細胞反應能夠預測出相應惡性細胞的反應（圖1-2）^[3]。

圖1-2. iQue®在造血細胞免疫表型分析中的應用及門控策略。使用7-AAD和Annexin-V分別對單核細胞的死細胞和凋亡細胞進行排除。根據其核心表面抗原的表達，檢測11個細胞亞群（造血干細胞（HSC/CD34+CD38-），普通祖細胞（CPC/CD34+CD38+）。

2    小分子化合物庫篩選

FOXP3+ Treg細胞在控制癌癥免疫反應中發揮著重要的作用，但是作為Treg細胞的主要調節因子，FOXP3在誘導的Treg細胞中的表達并不穩定，FOXP3的調控表達及Treg細胞功能的分子靶點也尚不明確。而能夠調節FOXP3表達及其下游基因（如CTLA4）的藥物靶點具有穩定Treg表型及功能的潛力。來自阿斯利康IMED生物技術部門的研究人員使用iQue®開發了一種自動化384孔板的高通量流式細胞術表型實驗，可用于測定人類Treg細胞中FOXP3和CTLA4的蛋白表達^[4]（圖2）。
 

圖2. 使用iQue®進行人類Treg細胞擴增、表征和表型篩選。(A）擴增的Treg細胞表達高水平的FOXP3和CTLA4；(B) 擴增的Treg細胞缺乏IL-2的產生；(C, D) 導致FOXP3 MFI增加或減少（C）和導致CTLA4 MFI增加（D）的代表性化合物的柱狀圖；(E）人類Treg細胞表型篩選簡要實驗流程，包括Treg細胞的分離、擴增、小分子化合物處理以及細胞活力、FOXP3和CTLA4表達。

3    蛋白激酶抑制劑化合物庫篩選

北卡羅來納大學藥理學院的研究人員使用iQue®篩選出了一個包含800多種蛋白激酶抑制劑的化合物庫，并確定了可在KRAS突變型胰腺導管腺癌（PDAC）細胞系中促進MYC癌蛋白穩定或降解的化合物^[5]（圖3）。由于KRAS信號使MYC變得穩定，進而促進PDAC的生長，因此深入了解這種穩定性的調節方式將有助于開發出治療極具挑戰性癌癥的療法。

圖3. MYC降解篩選優化。(A）GPS-MYC篩選示意圖。(B）GPS-MYC細胞用vehicle（DMSO）單一處理，或用MG132或CHX處理6小時，并在iQue®上進行分析。數據來自于每個對照組的前兩孔和后兩孔，分別代表實驗開始（0分鐘）和結束（45分鐘）。(C) GPS-MYC篩查是一式兩份的。數據與對照組DMSO（藍色圓圈，0%穩定）和MG132（綠色圓圈，100%穩定）進行歸一化處理，并以兩個重復的30%平均穩定率為界確定命中率。代表命中的圓圈以紫色顯示。圓圈的大小與每孔的事件數成正比。評估出的穩定化化合物在圖中標出。(D) 與(C)相同，除了對照組為DMSO（藍色圓圈，0%失穩）和CHX（紅色圓圈，100%失穩）。評估出的不穩定化合物被標出。

4   揭示小分子BH3模擬物抗癌機制

抑制癌細胞的抗凋亡機制也是一種極具前景的治療方法。小分子BH3模擬物能夠模擬BH3蛋白，抑制抗凋亡蛋白促細胞生存的功能，從而誘導癌細胞凋亡。要成為真正的BH3模擬物，就必須滿足2個標準：

1. 需要直接在已知抗凋亡依賴性細胞的線粒體上發揮作用；

2. 直接且選擇性抑制具有高親和力的抗凋亡蛋白。

來自美國丹娜法伯腫瘤醫院的科研人員開發了一套能夠綜合分析BH3模擬候選物，并進行高通量活性測試的方法。iQue®在此方法主要用于進行活性測試^[6]。
 

5   確定去鐵酮（DFP）的抗增殖機制

近期，佐治亞理工學院的一項研究中使用iQue®確定去鐵酮（DFP）的抗增殖機制[7]。DFP是2011年由FDA批準在美國上市的一種可口服的鐵螯合劑，與鐵具有良好的親和力，可有效地控制體內鐵負荷。研究人員發現，DFP的抗增殖活性主要來自其對鐵依賴組蛋白賴氨酸脫甲基酶（KDM）亞群的抑制。他們還發現了基于DFP的新型KDM抑制劑，該抑制劑對癌細胞系的細胞毒性更強。在小鼠異種移植模型中，僅一種先導化合物就能有效抑制乳腺腫瘤的生長。在該研究中，所有基于流式細胞術的測試均由iQue®完成。

為什么iQue®在小分子藥物開發中被廣泛認可？
 

• 更快的高通量篩選：96孔板分析僅需5分鐘，384孔板分析僅需20分鐘；

• 節約成本，加快研發速度：每個孔中采樣 1 µL，節省了試劑成本，保存了有限的樣本；

• 為懸浮細胞的高通量篩選賦能：對免疫調節劑或復雜的混合細胞（如 PBMC）的分析進行優化，并以單細胞的分辨率生成每種細胞類型的數據；

• 智能的數據分析處理：ForeCyt®軟件是基于微孔板整板分析的大型數據集，包括內置標準曲線和獨特功能（如 Profile Map）的數據分析和可視化工具，數據可輕松導出到您的電子實驗室筆記本系統

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-參考文獻-

1. Baccelli I, Gareau Y, Lehnertz B, et al. Mubritinib as a strong in vitro and in vivo anti-leukemic compound, acting through ubiquinone-dependent inhibition of electron transport chain complex I (ETC1). http://dx.doi. org/10.1101/513887

2. Kuusanmäki H, Leppä A-M, Pölönen P, et al. Phenotypebased drug screening reveals association between venetoclax response and differentiation stage in acute myeloid leukemia. Haematologica. 2020:105(3):708-720. doi: 10.3324/haematol.2018.214882.

3. ntasir MM, Leppä A-M, Hellesoy M, et al. Multiparametric single cell evaluation defines distinct drug responses in healthy hematological cells that are retained in corresponding malignant cell types. Haematologica. 2020;105(6):1527-1538. doi:10.3324/haematol.2019.217414.

4. Ding M, Brengdahl J, Lindqvist M, et al. A Phenotypic Screening Approach Using Human Treg Cells Identified Regulators of Forkhead Box p3 Expression. ACS Chem Biol. 2019;14(3):543-553. doi: 10.1021/acschembio.9b00075. Epub 2019 Mar 4. PMID: 30807094

5. Blake, DR, Vaseva AV, Hodge RG, et al. Application of a MYC degradation screen identifies sensitivity to CDK9 inhibitors in KRAS-mutant pancreatic cancer. Sci Signal. 2019;12(590):eaav7259. Doi: 10.1126/scisignal.aav7259.

6. Villalobos-Ortiz M, Ryan J, Mashaka TN, et al. BH3 profiling discriminates on-target small molecule BH3 mimetics from putative mimetics. Cell Death Differ. 2020;27(3):999-1007. doi:10.1038/s41418-019-0391-9.

7. Khodaverdian V, Tapadar S, MacDonald IA, et al. Deferiprone: pan-selective histone lysine demethylase inhibition activity and structure activity relationship study. Sci Rep. 2019;9(1):4802. doi:10.1038/s41598-019-39214-1.