細胞培養的注意事項及常見問題與解答
一、無菌操作
細胞培養最看重的就是無菌操作，無菌操作是細胞培養是否成功的關鍵點。
1、使用前用75%的乙醇擦拭細胞間的桌面、超凈臺、孵箱和離心機等；紫外照射細胞間和超凈臺30分鐘以上才可以進入使用。
2、進入細胞間必須穿上隔離服或者細胞間專用的白大衣，戴上手套和口罩，換上拖鞋，嚴格意義上來說，帽子也是要帶的。除了隔離服，其他穿著物品最好一次性使用。
3、凡是放入超凈臺中的不是一次性使用的物品事先都需要經過高壓滅菌；不能進行高壓處理的物品也需要經過75%的乙醇消毒。包括酒精燈、吸管、移液器、試管架、培養皿、廢液缸等。
4、操作過程中盡量接近酒精燈；用鑷子拿取槍頭、離心管、吸管等物品時，避免碰到使用端；不要在開口器皿的上端進行操作。
5、細胞間的設計都是一層層的隔間，每一層隔間的拉門都必須關好；當有人在超凈臺工作時，其他人員不允許進入操作區域。
二、培養基
1、培養基的選擇依細胞種類而定。如果是從別的實驗室借來的細胞，最初階段一定要保持細胞原有的培養條件；特殊種類的細胞，比如內皮細胞，可以借鑒網上培養成功的條件，添加一些特定成分。
2、液體培養基的保存條件應是冰箱4度冷藏。小六兒見過有的大實驗室細胞量多，一次性購買的培養基瓶數也多，有些人可能覺得-20冰箱保存時間會更久一些。但是經過冷凍后的培養基再溶化時，你會發現培養基的顏色發生變化，顏色變深，這就是培養基的PH值升高了。
3、培養基中都含有大量的谷氨酰胺，用來合成細胞生長所需要的核酸和蛋白質。但是谷氨酰胺在溶液中不穩定，保存4周后的培養基需要重新加入谷氨酰胺。所以盡量不要大批量購買培養，也不要一次配太多的培養基。
4、細胞適合的培養基PH值是7.2-7.4，偏高或偏低都不好，但相對于堿性條件而言，細胞更耐酸。原代細胞對PH值的變化很敏感，而永生性細胞相對來說忍受力更強一些。
5、造成皿或瓶內培養基PH值變化的原因有很多：細胞增殖速度的快慢、孵箱內二氧化碳的濃度不準確、培養瓶的蓋子擰緊或者發生了污染。如果發現細胞生長過慢，刨除細胞本身狀態的原因，可以在培養液中添加丙酮酸鈉（丙酮酸鈉是糖酵解的中間產物，為細胞生長提供ATP，提供合成大代謝所需要的碳源，使用濃度通常是0.1mM）。
6、細胞發生污染，培養基的PH值也會發生變化。如果新配置的培養基出現沉淀，很可能是廣口瓶沒有清洗干凈，瓶中殘留的磷酸鹽造成培養基成分的析出。
7、孵箱內濕度對維持培養基的滲透壓也有很重要的作用。大部分細胞適應的滲透壓在260-320mOsm/kg。濕度不夠時，培養基蒸發，液體的滲透壓就會升高。
8、培養基在使用前需提前從冰箱拿出，使其恢復至室溫或者37度水浴。
9、操作過程中，如果槍頭中已經有培養基或其他液體成分，不要再經過酒精燈被高溫加熱。高溫不僅會使有效成分失效，更有可能產生有毒物質。
10、我們購買的培養基瓶上都會標注避光保存，這是因為培養基中的某些成分遇光會產生過氧化氫，具有細胞毒性。我們在超凈臺中處理細胞時，因為時間較短，不會產生太大問題。但是如果長時間放置在室外或燈光下照射，或者有的冷藏冰柜的門是玻璃的，就會造成培養基質量的下降。
三、血清
1、血清分為：
a)新生牛血清（新生的小牛5天內取血）；
b)小牛血清（16周內的小牛取血）；
c)胎牛血清（剖腹取出胎兒制成的）。
2、我們買來的血清多處于冰凍狀態，滅活前放到4度冰箱，使其緩慢溶化。56度水浴45分鐘滅活，滅活后冷卻至室溫再放回冰箱冷凍層中。滅活是滅活補體系統中具有蛋白酶活性的成分，對于一些難養的細胞，滅活補體是很重要的。但是滅活的溫度也可能會破壞血清中的生長因子，所以到底該不該滅活血清，還沒有一個很明確的標準，可能還是要視情況而定吧。
3、血清在溶化過程中，纖維蛋白原會轉變成纖維蛋白，所以有時我們會看到絮狀物，但是這種情況是不影響血清的質量的。
四、傳代
1、貼壁細胞傳代時，先用消化液潤洗一遍；棄掉后，再加入適量消化液置于孵箱或鏡下觀察消化；當細胞變圓，彼此之間產生空隙，加入等量或大量的培養基終止消化，培養基中的血清可以抑制胰蛋白酶的活性。
2、這里我沒有明確提到胰蛋白酶的濃度，并不是說濃度越高越好。胰蛋白酶底物的特異性差，會破壞細胞膜成分。PH8.0，37度環境下，消化液的消化能力是最強的。培養基中的血清會降低胰酶的消化能力，所以每次消化前，也要用PBS反復沖洗干凈培養皿。日常用的比較多的消化液濃度：
a)0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA
b)0.05%胰蛋白酶+0.02%EDTA
c)0.25%胰蛋白酶
3、傳代后如果細胞不貼壁，可能的原因是胰蛋白酶消化過度或者沒有清洗干凈EDTA。
4、懸浮細胞傳代時，正常收集細胞、離心濃縮、用培養基重懸就可以了。懸浮細胞每次換液都需要離心重懸，但是由于懸浮細胞一般會處于單細胞層生長，有的時候生長速度很快，重懸后如果不晃動培養皿，就會看到細胞成團；如果經常顯示懸浮細胞大量抱團生長，也有可能是培養基中的血清問題、或者鈣鎂離子濃度的變化造成了細胞間的粘附力改變。
五、細胞死亡及生長異常
1、首先講一下細胞生長緩慢的原因：
a)更換了血清或者培養基，細胞需要一段時間適應一下；
b)由于細胞的特殊種類，培養基中缺少某些生長因子；
c)培養基中有少量真菌或者細菌污染；
d)傳代的時候細胞密度過低；
e)細胞狀態老化；
f)支原體污染。
2、解決上述問題的方法：
a)如果實驗室沒有某種細胞最適宜的培養基，可以先用原培養條件凍存一些，然后逐漸增加新的培養基比例，25%、50%、75%到100%，傳代3-5次后，讓細胞慢慢適應。
b)判斷是不是培養基發生污染，可以先不加抗生素，觀察細胞狀態。
c)增加細胞的接種密度。
d)發現細胞老化的時候，及時更換新的細胞。
e)如果懷疑是支原體污染，一定要隔離疑似污染的培養皿，及時清潔消毒孵箱。
3、造成細胞死亡的原因：
a)細胞消化過度；
b)沒有及時換液，營養成分消耗殆盡；
c)如果前一天細胞的狀態很好，換液之后就全死了，應該考慮是否是培養基或者血清的問題。
4、如何判定細胞是否發生支原體污染：可以選用直接培養法、熒光染色或PCR方法檢測，比較常用的是PCR。當細胞發生支原體污染時，原則上是能夠去除支原體的，但是整個過程耗時耗力，還要考驗個人操作能力。所以如果不是處于細胞存量很少的情況下，建議發現污染時立刻棄掉，重新培養。
5、如果孵箱中只是某種細胞持續性大量死亡，而其他細胞狀態都沒問題的話，基本上可以確定就是孵箱存在特異性感染這類細胞的真菌或細菌，遇到這種情況，小六兒也不知道該怎么做，只能是先停一段時間看看。。。。。。
6、其他注意事項：每個星期都要更換孵箱底盤中的水（紫外照射后超純水）；每兩周消毒一次孵箱：75%酒精擦拭一遍后，再用0.1%新潔爾滅擦拭一遍（都用超純水配制）；可以在孵箱底部放一個燒杯，里面放入飽和硫酸銅，可以抑制霉菌生長。不過也有人說硫酸銅會改變孵箱的PH值，如果不是孵箱污染的情況很嚴重，建議不要使用。
細胞培養最看重的就是無菌操作，無菌操作是細胞培養是否成功的關鍵點。
1、使用前用75%的乙醇擦拭細胞間的桌面、超凈臺、孵箱和離心機等；紫外照射細胞間和超凈臺30分鐘以上才可以進入使用。
2、進入細胞間必須穿上隔離服或者細胞間專用的白大衣，戴上手套和口罩，換上拖鞋，嚴格意義上來說，帽子也是要帶的。除了隔離服，其他穿著物品最好一次性使用。
3、凡是放入超凈臺中的不是一次性使用的物品事先都需要經過高壓滅菌；不能進行高壓處理的物品也需要經過75%的乙醇消毒。包括酒精燈、吸管、移液器、試管架、培養皿、廢液缸等。
4、操作過程中盡量接近酒精燈；用鑷子拿取槍頭、離心管、吸管等物品時，避免碰到使用端；不要在開口器皿的上端進行操作。
5、細胞間的設計都是一層層的隔間，每一層隔間的拉門都必須關好；當有人在超凈臺工作時，其他人員不允許進入操作區域。
二、培養基
1、培養基的選擇依細胞種類而定。如果是從別的實驗室借來的細胞，最初階段一定要保持細胞原有的培養條件；特殊種類的細胞，比如內皮細胞，可以借鑒網上培養成功的條件，添加一些特定成分。
2、液體培養基的保存條件應是冰箱4度冷藏。小六兒見過有的大實驗室細胞量多，一次性購買的培養基瓶數也多，有些人可能覺得-20冰箱保存時間會更久一些。但是經過冷凍后的培養基再溶化時，你會發現培養基的顏色發生變化，顏色變深，這就是培養基的PH值升高了。
3、培養基中都含有大量的谷氨酰胺，用來合成細胞生長所需要的核酸和蛋白質。但是谷氨酰胺在溶液中不穩定，保存4周后的培養基需要重新加入谷氨酰胺。所以盡量不要大批量購買培養，也不要一次配太多的培養基。
4、細胞適合的培養基PH值是7.2-7.4，偏高或偏低都不好，但相對于堿性條件而言，細胞更耐酸。原代細胞對PH值的變化很敏感，而永生性細胞相對來說忍受力更強一些。
5、造成皿或瓶內培養基PH值變化的原因有很多：細胞增殖速度的快慢、孵箱內二氧化碳的濃度不準確、培養瓶的蓋子擰緊或者發生了污染。如果發現細胞生長過慢，刨除細胞本身狀態的原因，可以在培養液中添加丙酮酸鈉（丙酮酸鈉是糖酵解的中間產物，為細胞生長提供ATP，提供合成大代謝所需要的碳源，使用濃度通常是0.1mM）。
6、細胞發生污染，培養基的PH值也會發生變化。如果新配置的培養基出現沉淀，很可能是廣口瓶沒有清洗干凈，瓶中殘留的磷酸鹽造成培養基成分的析出。
7、孵箱內濕度對維持培養基的滲透壓也有很重要的作用。大部分細胞適應的滲透壓在260-320mOsm/kg。濕度不夠時，培養基蒸發，液體的滲透壓就會升高。
8、培養基在使用前需提前從冰箱拿出，使其恢復至室溫或者37度水浴。
9、操作過程中，如果槍頭中已經有培養基或其他液體成分，不要再經過酒精燈被高溫加熱。高溫不僅會使有效成分失效，更有可能產生有毒物質。
10、我們購買的培養基瓶上都會標注避光保存，這是因為培養基中的某些成分遇光會產生過氧化氫，具有細胞毒性。我們在超凈臺中處理細胞時，因為時間較短，不會產生太大問題。但是如果長時間放置在室外或燈光下照射，或者有的冷藏冰柜的門是玻璃的，就會造成培養基質量的下降。
三、血清
1、血清分為：
a)新生牛血清（新生的小牛5天內取血）；
b)小牛血清（16周內的小牛取血）；
c)胎牛血清（剖腹取出胎兒制成的）。
2、我們買來的血清多處于冰凍狀態，滅活前放到4度冰箱，使其緩慢溶化。56度水浴45分鐘滅活，滅活后冷卻至室溫再放回冰箱冷凍層中。滅活是滅活補體系統中具有蛋白酶活性的成分，對于一些難養的細胞，滅活補體是很重要的。但是滅活的溫度也可能會破壞血清中的生長因子，所以到底該不該滅活血清，還沒有一個很明確的標準，可能還是要視情況而定吧。
3、血清在溶化過程中，纖維蛋白原會轉變成纖維蛋白，所以有時我們會看到絮狀物，但是這種情況是不影響血清的質量的。
四、傳代
1、貼壁細胞傳代時，先用消化液潤洗一遍；棄掉后，再加入適量消化液置于孵箱或鏡下觀察消化；當細胞變圓，彼此之間產生空隙，加入等量或大量的培養基終止消化，培養基中的血清可以抑制胰蛋白酶的活性。
2、這里我沒有明確提到胰蛋白酶的濃度，并不是說濃度越高越好。胰蛋白酶底物的特異性差，會破壞細胞膜成分。PH8.0，37度環境下，消化液的消化能力是最強的。培養基中的血清會降低胰酶的消化能力，所以每次消化前，也要用PBS反復沖洗干凈培養皿。日常用的比較多的消化液濃度：
a)0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA
b)0.05%胰蛋白酶+0.02%EDTA
c)0.25%胰蛋白酶
3、傳代后如果細胞不貼壁，可能的原因是胰蛋白酶消化過度或者沒有清洗干凈EDTA。
4、懸浮細胞傳代時，正常收集細胞、離心濃縮、用培養基重懸就可以了。懸浮細胞每次換液都需要離心重懸，但是由于懸浮細胞一般會處于單細胞層生長，有的時候生長速度很快，重懸后如果不晃動培養皿，就會看到細胞成團；如果經常顯示懸浮細胞大量抱團生長，也有可能是培養基中的血清問題、或者鈣鎂離子濃度的變化造成了細胞間的粘附力改變。
五、細胞死亡及生長異常
1、首先講一下細胞生長緩慢的原因：
a)更換了血清或者培養基，細胞需要一段時間適應一下；
b)由于細胞的特殊種類，培養基中缺少某些生長因子；
c)培養基中有少量真菌或者細菌污染；
d)傳代的時候細胞密度過低；
e)細胞狀態老化；
f)支原體污染。
2、解決上述問題的方法：
a)如果實驗室沒有某種細胞最適宜的培養基，可以先用原培養條件凍存一些，然后逐漸增加新的培養基比例，25%、50%、75%到100%，傳代3-5次后，讓細胞慢慢適應。
b)判斷是不是培養基發生污染，可以先不加抗生素，觀察細胞狀態。
c)增加細胞的接種密度。
d)發現細胞老化的時候，及時更換新的細胞。
e)如果懷疑是支原體污染，一定要隔離疑似污染的培養皿，及時清潔消毒孵箱。
3、造成細胞死亡的原因：
a)細胞消化過度；
b)沒有及時換液，營養成分消耗殆盡；
c)如果前一天細胞的狀態很好，換液之后就全死了，應該考慮是否是培養基或者血清的問題。
4、如何判定細胞是否發生支原體污染：可以選用直接培養法、熒光染色或PCR方法檢測，比較常用的是PCR。當細胞發生支原體污染時，原則上是能夠去除支原體的，但是整個過程耗時耗力，還要考驗個人操作能力。所以如果不是處于細胞存量很少的情況下，建議發現污染時立刻棄掉，重新培養。
5、如果孵箱中只是某種細胞持續性大量死亡，而其他細胞狀態都沒問題的話，基本上可以確定就是孵箱存在特異性感染這類細胞的真菌或細菌，遇到這種情況，小六兒也不知道該怎么做，只能是先停一段時間看看。。。。。。
6、其他注意事項：每個星期都要更換孵箱底盤中的水（紫外照射后超純水）；每兩周消毒一次孵箱：75%酒精擦拭一遍后，再用0.1%新潔爾滅擦拭一遍（都用超純水配制）；可以在孵箱底部放一個燒杯，里面放入飽和硫酸銅，可以抑制霉菌生長。不過也有人說硫酸銅會改變孵箱的PH值，如果不是孵箱污染的情況很嚴重，建議不要使用。
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