Ampha Z32：定量細菌孢子萌發(fā)以評估宿主菌群對艱難梭菌感染的敏感性
孢子萌發(fā)對于細菌定殖是必要的第一步，孢子在結腸中的萌發(fā)速率依賴于宿主菌群的組成，宿主菌群可調控初級及次級膽鹽水平以控制艱難梭菌的孢子萌發(fā)。Biosensors and Bioelectronics上發(fā)表了一項最新研究，基于萌發(fā)的孢子有著更高的凈電導率這一特征，開發(fā)了一種基于阻抗檢測的高通量單細胞計數(shù)法（Ampha Z32阻抗流式細胞儀，瑞士Amphasys），僅需4小時（傳統(tǒng)方法需24小時）即可評估艱難梭菌的孢子萌發(fā)情況，并可用于評估宿主菌群對艱難梭菌感染的易感性。
① 利用高通量單細胞阻抗計數(shù)法（>300 events/s）對活細菌細胞進行定量；
② 相比于傳統(tǒng)的菌落分析方法（需24h），該方法僅需培養(yǎng)4h即可評估孢子萌發(fā)情況，檢測下限為每50μL樣本中約100個活細胞；
③ 萌發(fā)的艱難梭菌孢子有更高的凈電導率，這在中等導電介質（0.8S/m）內造成了獨特的高頻（10 MHz）阻抗相分散（活細胞與失活細胞離散）；
④ 該方法可對比在不同的初級膽鹽水平下的艱難梭菌孢子萌發(fā)速率，并可用于評估宿主對艱難梭菌感染的易感性。
圖1 實驗方案
圖1（a） 艱難梭菌孢子萌發(fā)到其營養(yǎng)體形式受到“正常”菌群中共生細菌的抑制，該菌群分泌水解酶，能夠代謝初級膽鹽為次級膽鹽，而缺乏共生細菌的抗生素破壞菌群表現(xiàn)出較高的初級至次級膽鹽水平，導致孢子萌發(fā)增強；（b） 整體實驗時間表：包括孢子預處理、細菌生長、IFC（阻抗流式細胞儀）微流控表型分析和菌群驗證；（c）阻抗式細胞儀分析的具體樣品制備步驟；（d） 來自抗生素處理的小鼠模型的宿主菌群樣本的采集、制備和分析步驟。
圖2. 艱難梭菌UK1孢子在不同水平牛磺膽酸鹽的標準生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)后的微生物學分析
圖2（a） 24小時內的生長曲線顯示，隨著牛磺膽酸鹽水平的增加，孢子萌發(fā)率逐漸提高，由于營養(yǎng)性艱難梭菌的存在， 0.001% 、0.01%和 0.1%牛磺膽酸鹽水平下的吸光度分別在20h、18h、15h（用虛線標記）與無牛磺膽酸鹽的對照組的吸光度相比，出現(xiàn)顯著差異（*p<0.05）；（b） 24小時后的CFU分析結果顯示，含有0.1%牛磺膽酸鹽的生長培養(yǎng)基的孢子萌發(fā)顯著（****p<0.0001），而其他牛磺膽酸鹽水平下孢子萌發(fā)并不明顯；（c）培養(yǎng)4小時后的DEP歸一化光譜和頻譜結果顯示，含有0.1%牛磺膽酸鹽的DEP歸一化光譜與同質營養(yǎng)體艱難梭菌勻質樣品的DEP歸一化光譜（實線）極為相似，根據(jù)異質樣本的凈電生理特性可以推斷，在0.1%牛磺膽酸處理的樣本中存在營養(yǎng)體艱難梭菌亞群，這與傳統(tǒng)法分析（圖2a和b）的評估結果一致，但檢測可在更短時間內進行（4小時.VS >15小時）。
圖3 營養(yǎng)體艱難梭菌細胞和孢子的多殼層介電模型&均質種群的歸一化DEP光譜
圖3（a） 基于營養(yǎng)體細胞和孢子的大小、形狀和結構差異，生成多殼層介電模型；（b） 營養(yǎng)體細胞和孢子均質種群的歸一化DEP光譜結果表明，不同樣品類型的極化和電生理特性存在明顯差異。低于100 kHz的電場頻率下，營養(yǎng)體艱難梭菌細胞因絕緣細胞外殼表現(xiàn)為nDEP（負DEP），但在高于1 MHz的電場頻率下，營養(yǎng)體艱難梭菌因細胞內部的導電細胞質而發(fā)生極化，表現(xiàn)出pDEP（正DEP）。
由于孢子萌發(fā)過程中樣品的異質性，研究可利用Ampha Z32阻抗流式細胞儀（IFC法）通過檢測營養(yǎng)體艱難梭菌的電生理學特征來鑒定孢子萌發(fā)，并量化營養(yǎng)體艱難梭菌的比例。圖4為不同頻率（0.5 MHz (a & d)、2 MHz (b & e)、10 MHz (c & f)）、不同介質導電條件（0.5× PBS（a-c）、1× PBS（d–f) ）下，艱難梭菌活細胞營養(yǎng)體與熱滅活后的艱難梭菌細胞的阻抗數(shù)據(jù)（相位-振幅）疊加圖。對比可知，0.5× PBS（介質電導率為 0.8 S/m），10 MHz 下二者的區(qū)分度最佳，篩選門控可設于218°相位處（圖4c實線），此時艱難梭菌活細胞占比＞95%。
圖5 不同牛磺膽酸鹽水平、不同培養(yǎng)時間下艱難梭菌活細胞的占比（IFC法：0.5× PBS，10 MHz）
圖5顯示孢子萌發(fā)率隨生長培養(yǎng)基中牛磺膽酸鹽水平以及萌發(fā)時間的增加而增加，其中0.1% 牛磺膽酸鹽的生長培養(yǎng)基中培養(yǎng) 4 小時后，孢子萌發(fā)率約為 30%（每50μL 樣品約 250 個營養(yǎng)體艱難梭菌細胞），而0.05–0.1%牛磺膽酸鹽的生長培養(yǎng)基中萌發(fā) 5 小時后，孢子的萌發(fā)率可達80%以上；該測定結果表明艱難梭菌對培養(yǎng)時間和生長培養(yǎng)基中初級膽汁鹽（牛磺膽酸鹽）比例的變化表現(xiàn)出良好的敏感性。
圖6 未處理和抗生素處理的艱難梭菌孢子萌發(fā)實驗比較（宿主菌體外菌群）
本研究使用從小鼠模型獲得的體外菌群樣品進一步驗證了實驗結果的可靠性。在使用克林霉素進行抗生素治療10天后，按照圖1d的步驟進行了艱難梭菌孢子萌發(fā)實驗。CFU分析（圖6a）結果顯示，未經(jīng)處理的菌群的孢子發(fā)芽率明顯較低，而克林霉素處理的菌群培養(yǎng)24小時后，孢子萌發(fā)水平顯著提高（**p<0.01），表明抗生素處理后菌群多樣性的減少可能會提高艱難梭菌的萌發(fā)率，這與此前的研究結果一致。而使用阻抗流式細胞儀（IFC法）在培養(yǎng)4小時后即可檢測出未處理和抗生素處理的艱難梭菌孢子萌發(fā)率（***p<0.001，圖6b）和孢子數(shù)量（**p<0.01，圖6c）上的顯著差異。這表明與CFU法相比，IFC法具有更高的靈敏性，可以更早檢測出宿主菌群對艱難梭菌孢子萌發(fā)的敏感性差異（4h與 24 h）。
綜上所述，Ampha Z32阻抗流式細胞儀（IFC法）可用于識別艱難梭菌營養(yǎng)體，量化宿主菌群對艱難梭菌孢子萌發(fā)率的影響，并在較短時間內檢測出宿主菌群對艱難梭菌孢子萌發(fā)的敏感性差異。該方法檢測靈敏度高、測量快速、樣品制備簡單，有潛力進一步用于CDI臨床測量的基準測試，調查抗生素治療下腸道菌群隨時間變化的敏感性差異，并通過初始和復發(fā)艱難梭菌感染的易感性指導臨床管理決策。
—— 原文 ——
John H. Moore et al. Quantifying bacterial spore germination by single-cell impedance cytometryfor assessment of host microbiota susceptibility to Clostridioides difficileinfection. Biosensors and Bioelectronics, Volume 166, 2020, 112440, ISSN0956-5663.
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