新冠疫情爆發以來，多種不同的疫苗(mRNA疫苗、慢病毒疫苗、滅活病毒等)在全世界的抗疫中發揮了重大作用。然而現有的疫苗也有一些局限性，如儲存運輸條件苛刻、需要接種加強針、對突變病毒不敏感等等。最近，bioRxiv發表了一篇基于細菌外泌體的新型新冠疫苗對疾病保護作用的文章，或許可以為新冠疫苗的研發提供新的思路。

    Jiang和Driedonks等^[1]通過對細菌來源的外囊泡表面修飾病毒S蛋白的受體結合結構域（RBD）制成了新型新冠疫苗。革蘭氏陰性菌能夠產生外膜囊泡（OMV），在哺乳動物體內具有免疫刺激作用，可誘導免疫應答發生并激活樹突細胞、T細胞、B細胞等免疫細胞，而經過改造的工程菌產生的OMV內毒性非常低，避免了不良反應的發生。作者使用了一種鼠傷寒沙門氏菌株，通過Spycatcher/Spytag體系使該菌株分泌的OMV通過共價鍵穩定結合了病毒的RBD（圖1）。

圖1 （A）RBD重組抗原的設計，RBD連接到SpyTag的N端和C端；（B）RBD修飾的OMV示意圖。

    研究人員在RBD-OMV制備完成后，使用全自動外泌體熒光檢測分析系統Exoview檢測OMV表面是否成功結合了病毒RBD。其中，檢測芯片上包被了D001, D003, MM43三種病毒S蛋白以及LPS的抗體，分別用于捕獲RBD-OMV和所有OMV；捕獲完成后使用熒光抗體標記對D001, D003, MM43進行表型分析。最后，使用Exoview的SP-IRIS無標記成像技術檢測了OMV是否被成功捕獲，并通過熒光成像統計捕獲的不同表型OMV的數量。

圖2 RBD-OMV捕獲數量及表型檢測。A：SP-IRIS技術檢測不同抗體捕獲的OMV數量；B：熒光檢測不同表型OMV數量。

圖3 對照組捕獲數量及表型檢測。A：SP-IRIS技術檢測不同抗體捕獲的OMV數量；B：熒光檢測不同表型OMV數量。

圖4 RBD-OMV與對照組的捕獲的不同表型OMV數量對比。

    圖2A顯示S蛋白抗體和LPS抗體均捕獲到了數量相當的OMV，表示OMV以很高的效率成功結合了新冠病毒的RBD。圖2B的熒光標記結果也證明了結合成功，但是結合D003的OMV數量相對較低。圖3A和圖3B的對照組結果表示僅有LPS抗體能夠捕獲到OMV，并且幾乎沒有熒光標記，表面對照組OMV上沒有結合RBD，將RBD-OMV與對照組的數據統計對比（圖4），說明RBD-OMV疫苗的特異性非常好。

    RBD-OMV疫苗制備完成后，研究人員使用倉鼠模型對疫苗接種的效果進行了檢測。實驗分為三組：接種疫苗的實驗組（RBD-OMV），接種溶劑的溶劑對照組（mock）和接種未結合RBD的OMV的空白對照組（Ctrl-OMV）。研究人員對不同組別分別接種后，使用病毒感染倉鼠，并進行了一系列測試以驗證疫苗效果。

圖5 RBD-OMV與mock、Ctrl-OMV的體重。A&B：接種完成后，病毒感染前的體重記錄；C&D：病毒感染后的體重變化。

    體重檢測結果顯示，在病毒感染前，三組倉鼠的體重，無論雄性和雌性，隨時間均沒有顯著改變（圖5A&B）；病毒感染后，RBD-OMV組體重沒有下降，而mock與Ctrl-OMV組體重下降，在第三、四天達到顯著（圖5C&D）。

圖6 A：接種后Day42的抗S-RBD IgG滴度；B：抗S-RBD   IgG滴度隨時間的變化；C&D&E：Day48的BAL中抗S-RBD   IgG/IgM/IgA的滴度；F：病毒中和抗體測試的中和抗體滴度隨時間的變化；G：Day35 WT和Delta病毒株的中和抗體滴度比較。

    血漿S-RBD IgG滴度測試結果顯示，接種后42天，RBD-OMV組的血漿S-RBD   IgG滴度更高，而兩個對照組的滴度位于檢測限度以下（圖6A）。為檢測呼吸道黏膜的抗體水平，研究人員檢測了肺泡灌洗液（BAL）的抗體滴度，RBD-OMV組中可檢測到IgG/IgM/IgA，兩個對照組則未檢測到。中和抗體測試表明，WT病毒株感染的抗體滴度與14天開始上升，于28天達到峰值并可保持到35天（圖6F）；抗體的中和活性在Delta和WT中沒有顯著差異（圖6G）。

圖7A：肺部組織中的病毒滴度；B：BAL中的病毒滴度

    TCID50檢測結果顯示，肺部組織（圖7A）和BAL（圖7B）中RBD-OMV組病毒滴度顯著低于兩個對照組，BAL組已達到檢測最低限度。

圖8 A：Day48不同組別倉鼠的肺部形態；B&C：H&E染色結果及病變積分。

    于48天處死倉鼠并分離肺部，肉眼觀察可見RBD-OMV組的炎癥和出血病灶少于兩個對照組，具有更少的肺泡水腫（圖8A）；肺組織切片的H&E染色結果也顯示，RBD-OMV組的炎癥、出血病灶和肺泡萎陷更少，且雄性的病變積分更低（圖8B&C）。

    以上所有檢測結果表明，這種RBD-OMV疫苗可誘導抗體分泌，分泌的抗體能夠中和野生型和Delta亞種病毒，證明了疫苗具有保護作用。OMV等外泌體疫苗具有如下優勢：

• 產量高：細菌復制快，且能夠大量分泌OMV；

• 多功能：表面可修飾多種抗原；

• 組分構成簡單：疫苗不需要其他佐劑；

• 穩定性高：在室溫下也能夠保持穩定，可以凍干粉末的形式在低溫長期保存。

    以上結果說明，基于OMV的外泌體疫苗具有廣泛的應用前景，可作為阻斷新冠肺炎以及其他傳染病傳播的有效手段。

    在這項研究中，作者使用Exoview系統對結合了重組RBD的OMV進行了表征分析，確定OMV上成功結合了新冠病毒的RBD。Exoview在外泌體疫苗開發中，可快速準確地表征外泌體，并統計不同表型外泌體數量并計算其比例，適合作為多組分外泌體疫苗的標準檢測手段。

參考文獻：

[1]. Linglei Jiang, Tom Driedonks, Maggie Lowman,   Wouter S.P. Jong, ... & Kenneth W. Witwer. (2021). A bacterial   extracellular vesicle-based intranasal vaccine against SARS-CoV-2 protects   against disease and elicits neutralizing antibodies to wild-type virus and   Delta variant. bioRxiv. .

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