LIT927(CXCL12 配體)--有望治療炎癥疾病
我們知道，當趨化因子與相應的受體結合后，可以控制免疫細胞在組織器官和循環系統中遷移路徑，從而到達受感染部位并執行清除感染源、消滅異常增殖細胞、促進傷口愈合等功能。此外，趨化因子還參與胚胎期免疫系統、循環系統和中樞神經系統的形成和發育[1]。
當前已報道的趨化因子在功能上具有一些共同的特征，比如分子量小（約 8 -14 KDa），有四個位置保守的半胱氨酸殘基以保證其三級結構。其中趨化因子 CXCL12 又稱基質細胞衍生因子-1(SDF-1)，包括兩種形式：SDF-1α/CXCL12a 和 SDF-1β/CXCL12b。研究表明，CXCL12 通過與受體 CXCR4 或 CXCR7 相互作用進而調節白細胞的定向遷移，與許多疾病有關，包括慢性炎癥、自身免疫性疾病(紅斑狼瘡)、癌癥、動脈粥樣硬化、艾滋病[1]。雖然 CXCR4 或 CXCR7 作為藥物靶點被廣泛的研究，然而臨床實驗的失敗卻令人失望。本研究從一個新的角度出發，通過尋找趨化因子 CXCL12 拮抗劑，進而減少 CXCL12 與相應受體的結合，從而應用于炎癥疾病的治療。
Regenass,P.等作者前期通過高通量篩選發現的 CXCL12 小分子配體-查爾酮-4（Chalcone-4，1），其可以通過與 CXCL12 結合，進而阻斷 CXCL12 與 CXCR4 的結合。然而，化合物 Chalcone-4 存在一些致命的缺點：（1）水溶性差（2）分子中存在 Michael 加成受體，容易與巰基發生反應（3）在氣道嗜酸細胞增多癥的過敏性哮喘小鼠模型中，口服無效，因此阻礙了其進一步的藥物研發。本文針對化合物 Chalcone-4 的缺點從四個角度進行結構優化：（1）探索 A 環取代基的影響；（2）探索 B 環取代基的影響；（3）母核替換的影響；（4）增加分子的剛性。經過大量的結構優化，最后獲得了含有嘧啶酮結構的全新 CXCL12 拮抗劑 LIT-927（57），其不僅水溶性優于 Chalcone-4，而且不包含 Michael 加成受體。該化合物和 Chalcone-4 均能夠減少氣道嗜酸細胞增多癥的過敏性哮喘小鼠模型中嗜酸性粒細胞的聚集。值得注意的是，LIT-927 是唯一一個在口服給藥后顯示抑制活性的藥物。
圖1. 化合物 Chalcone-4 的構效關系研究
化合物 Chalcone-4（1）是首個報道的 CXCL12 有機小分子拮抗劑，作者通過四個方面的結構優化：（1）A 環的變動；（2）B 環的變動；（3）中間母核部分的變動；（4）通過電子等排的策略增加分子的剛性，同時又保持分子的構象不變。所有合成的化合物采用基于FRET的結合力實驗測試與 CXCL12 蛋白的結合力。將活性較好的幾個化合物進行溶解度和穩定性的評價，結果如圖2所示，化合物 LIT-927（57）的綜合性質最優，其 Ki 值為 267nM，在 PBS 中的溶解度為 36.4 μM，優于化合物 Chalcone-4。 
圖2.代表性化合物的溶解性和穩定性評價
挑選 6 個代表性的化合物進行體內抗炎效果的評價。選用氣道嗜酸細胞增多癥的過敏性哮喘小鼠模型，每種化合物（300 nmol／kg，10% pBs/CDX）通過鼻腔途徑給藥，測試結果如圖 3 所示。化合物 6 雖然溶解度較差，但其產生了一定的效果，減少了 36% 嗜酸性粒細胞的滲入，與化合物 1 相當。而化合物 45, 65和67 沒有產生效果，因此后續將不對這三個化合物進行研究。有意思的是，化合物 50和 57在體外與它們具有相似的活性，但在體內卻擁有較好的活性，分別減少了 39% 和 48% 嗜酸性粒細胞的滲入（圖3A）。最后挑選化合物 57 作為先導化合物進行研究，化合物 57 在該模型中的體內 IC50 為 310 nmol/kg，而化合物 1 由于溶解度較差，因此其 IC50 大于 500 nmol/kg（圖3B）。
圖3. 化合物對氣道嗜酸細胞增多癥的過敏性哮喘小鼠模型體內抗炎活性的評價
鑒于化合物 57 是一個含有嘧啶酮結構的全新分子，又進一步進行了三方面的評價：（1）嘧啶酮結構的 Michael 加成受體反應活性；（2）與 CXCL12 的結合活性；（3）對其它趨化因子的選擇性。化合物 57 和 1 的 Michael 加成受體反應活性采用加入 GSH 的方式進行評價，LC-MS 分析顯示化合物 57 的反應活性明顯低于 1。結合力實驗測試表明，化合物 57 與 CXCL12 的解離平衡常數（Kd）為 780 nM，與之前采用 FRET 實驗測得的 Ki 值（267 nM）在同一數量級。選擇性評價（圖5）顯示，化合物 1 和 57 對其它趨化因子均具有較好的選擇性。
圖4.化合物 57 和 68 的結構及其活性測試
圖5. 化合物的選擇性測試
小M 的小思考：
趨化因子及其受體因特殊的生物學功能，使之成為潛在的藥物靶點。其中CXCL12/CXCR4 生物軸尤其重要，廣泛參與了炎癥、腫瘤、病毒感染、心血管等多種病理過程。采用小分子拮抗劑或者單克隆抗體阻斷這一相互作用可用于多種疾病的治療。雖然基于阻斷 CXCL12/CXCR4 相互作用的小分子拮抗劑有很多，但大部分研究均集中于 CXCR4 受體上。因此， Regenass,P.等作者從一個全新的角度出發，通過針對 CXCL12 去尋找小分子拮抗劑，最終發現了化合物 LIT-927 可以阻斷 CXCL12 與 CXCR4 的結合，并且是首個在氣道嗜酸細胞增多癥的過敏性哮喘小鼠模型中具有口服效力的藥物，未來具有應用于治療炎癥疾病的潛力。
參考文獻
[1] Koenen,R. R.，et al. Therapeutic targeting of chemokine interactions inatherosclerosis. Nat. Rev. Drug Discovery 2010, 9, 141−153;
[2] Regenass,P.; Bonnet, D. et al. Discovery of a Locally and Orally Active CXCL12Neutraligand (LIT-927) with Anti-inflammatory Effect in a Murine Model ofAllergic Airway Hypereosinophilia. J MedChem. 2018
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