類器官技術建立在干細胞技術以及經典發育生物學和細胞混合實驗的基礎之上；類器官的出現無疑是對干細胞研究不懈探索的驚喜回饋。

 

腸上皮是成年哺乳動物中自我更新最快的組織，自 2007 年，Hans Clevers 實驗室就通過譜系追蹤 (lineage tracing) 發現腸道 Wnt 靶基因中隱窩基底循環柱狀細胞表達的 Lgr5 (leucine-rich-repeat-containing G-protein-coupled receptor 5, Gpr49) 可作為腸和結腸的干細胞的成體干細胞標志物，這也就是大名鼎鼎的 Lgr5⁺ 細胞。

 

2009 年，Hans Clevers 和 Toshiro Sato 用來源于小鼠腸道的成體干細胞培育出首個微型腸道 (Mini-guts) 類器官，開啟了類器官技術的發展的“新紀元”。

 

圖 1. 類器官培養發展時間軸^[2]

 
腸道類器官技術已被廣泛應用于多種領域，包括疾病建模、藥物開發和篩選、宿主-微生物相互作用、腸道生物學與發育等。
也有研究描述了將基因組編輯技術，如 CRISPR/Cas9 與類器官培養系統結合，使類器官易于基因操縱，并將其轉化為一個多功能的培養系統。因此，腸類器官培養系統開啟了小腸上皮體外建模的新時代，在個性化和再生醫學中具有廣闊的應用前景。
 
   
 
3D 腸類器官由一個封閉的循環中空腔組成，內襯一層腸上皮細胞系。腸上皮的分化細胞系，包括腸上皮細胞，腸內分泌細胞和杯狀 (Paneth) 細胞，排列在絨毛狀區內。
 

腸類器官的發育類器官可來源于器官限制成體干細胞 (ASCs) 和多能干細胞 (PSCs) 兩種干細胞。這兩種干細胞來源產生的類器官包含體內發現的所有腸上皮細胞類型，比例和排列相似。

 

 
培養類器官的主要成分是細胞外基質和培養基，培養基中添加促腸道發育的生長因子。其中，細胞外基質 (ECM) 為干細胞的粘附、生長和分化提供了必需的結構支持和生化誘因。類器官的形成和生長在很大程度上依賴于培養基成分，這些成分構成了十分接近體內干細胞生態位 (Niche) 的信號通路，以維持干細胞的功能，促進其擴展和分化為器官的特定細胞類型。
 
如果把腸道類器官培養當成是養成游戲，那么該怎么喂養呢，“定食” 還是“DIY 自助餐”？

 

圖 3. 體外培養 PSC 來源的腸類器官^[3]

 

■ 基礎套餐來一套：

腸道類器官培養基的關鍵成分包括 Wnt-3a (W)、表皮生長因子 (EGF) (E)、Noggin (N) 和 R-spondin-1 (R)，統稱為 WENR 培養基。在培養基中有序地添加這些生長因子可調控干細胞生態位信號通路 (包括 Wnt、骨形態發生蛋白 (BMP) 和 Notch 信號通路)，誘導腸道干細胞 (ISCs) 自我更新、增殖和分化。

 

■ “自助”更有它的妙：

也有一些研究表明，向 ENR 培養基 (包含 EGF + Noggin + R-spondin-1) 中加入其它成分，以誘導干細胞走向特定的分化命運。

 

例如，引入兩種小分子的組合，如 CHIR99021 + Valproic acid 或者是 LDN-193189 + CHIR99021，可協同促進 Lgr5⁺ ISCs 在自我更新和未分化狀態下的維持，得到富含 ISCs 的培養。

 

通過補充 DAPT + CHIR99021、Valproic acid + IWP-2 或 DAPT + IWP-2 的 ENR 培養基培養可獲得分化表型，這些分子相互配合誘導 ISCs 直接分化為 Paneth 細胞 (杯狀細胞) 及腸細胞和分泌細胞譜系 (腸內分泌細胞)。也有人認為，DAPT 或 BMP 分子的加入足以促進 ISC 分化并產生多譜系腸類器官。

 

雖然關于類器官培養基的組成有詳細的綜述，但不同方案的成分有時會存在差異，在培養技術中需要大量的試驗和摸索，以確定劑量和時機，達到預期結果。

 

 

2020 年 3 月，類器官“鼻祖” Hans Clevers 的團隊再在 Science 上發表大作：SARS-CoV-2 productively infects human gut enterocytes，揭示了新型冠狀病毒對人類腸道的有效感染。他們靈活運用腸道類器官的培養條件，將病毒對人類腸道的感染可視化。

 

hSIO (human small intestinal organoids; 人類小腸類器官) 由原代腸道上皮干細胞建立，通過符合倫理規范途徑獲得人類腸道組織樣本。他們設定了四種不同培養（EXP、DIF、DIF-BMP、EEC）條件：

 

EXP：在 Wnt EXP (Expansion medium) 中生長的 hSIO 絕大多數由干細胞和腸細胞祖細胞組成，與 Wnt 條件培養基不同，培養基中添加 Wnt 替代物 (U-Protein Express)。

 

DIF：在 ENR 中實現了一般分化，稱為 DIF (differentiation medium)，在 DIF 培養基中生長的類器官含有腸細胞、杯狀細胞和少量腸內分泌細胞 (EEC)。

 

DIF+BMP：通過從 ENR 中除去 Noggin 并添加 BMP-2/BMP-4 激活 BMP，導致進一步成熟。

 

EEC: 在 DIF + BMP 的條件下，用強力霉素 (Doxycycline) 在 ENR 培養基中穩定轉染的載體中誘導 NeuroG3 的表達，以誘導 EEC 數量增加。

 

如圖 3 所示，四種培養條件下生長的 hSIO 暴露于 SARS-CoV  和 SARS-CoV-2 2 種病毒。在所有培養條件下，兩種病毒的傳染性病毒顆粒和病毒 RNA 的滴度均顯著增加。

 

 

圖 4：SARS-CoV 和 SARS-CoV-2 在 hSIO 中復制^[12]

SARS-CoV（藍）SARS-CoV-2（紅）感染后 24、48 和 60 小時，測定裂解的類器官活病毒滴度。

 

為了確定病毒目標細胞類型，對 hSIO 進行了共聚焦分析，不同的培養條件下共聚焦分析顯示，SARS-CoV-2 的目標細胞為增殖的腸上皮細胞祖細胞 (EXP 條件下) 或有絲分裂后的腸細胞 (DIF 條件下)，而腸內分泌細胞幾乎沒有感染。

 

 

圖 5. SARS-CoV-2 感染 hSIO 的共聚焦分析^[12]

類器官腸上皮細胞刷狀緣肌動蛋白通過 Phalloidin 標記 (綠色)，DAPI 標記細胞核 (藍色)，病毒 dsRNA 染色顯示感染細胞。A. 增殖的細胞在擴張的類器官中體現，Ki67 標記增殖細胞 (紅色)；B. 腸上皮細胞在分化的類器官中體現，APOA1 標記有絲分裂后的腸細胞 (紅色)

 

看到這里，不得不稱贊一句 Hans Clevers 類器官培養玩兒得真溜！絕絕子！

 

相關產品

Wnt3a Wnt 參與調節細胞發育、增殖、分化、粘附、極性、細胞-細胞通信、生存和自我更新功能。Wnt3a 是類器官構建最常用的培養因子之一。

EGF 上皮組織生長因子 EGF 與其受體結合，誘導增生性變化。EGF 是胃腸道、肝臟、甲狀腺、腦等類器官培養所需因子。

R-spondin-1 R-spondin-1 在干細胞的自我更新和 Wnt 信號的激活中發揮作用。它能誘導腸隱窩上皮細胞增殖，促進腸上皮愈合，支持腸上皮干細胞更新，是小鼠/人類器官祖干細胞維持和增殖的關鍵因子。

Noggin Noggin 是骨形態發生蛋白的內源性抑制劑，調節細胞分化、增殖和凋亡。它是最基礎的類器官培養因子之一。

BMP-2、BMP-4 BMP 在胚胎發生、發育和維持組織穩態中起著至關重要的作用。

CHIR-99021 選擇性的 GSK3 抑制劑，可用于類器官的生成。CHIR99021+Valproic acid 或者是 CHIR99021+LDN-193189，可協同促進 Lgr5+ ISCs 在自我更新和未分化狀態下的維持，得到富含 ISCs 的培養。

Valproic acid HDAC 的抑制劑；在類器官培養中，Valproic acid 和 CHIR99021 的組合可協同促進 Lgr5+ ISCs 在自我更新和未分化狀態下的維持，得到富含 ISCs 的培養。

LDN-193189 一種選擇性的 BMP I 型受體抑制劑，抑制 ALK2 和 ALK3 的 IC50 分別為 5 nM 和 30 nM。

IWP-2 Wnt 加工和分泌的抑制劑，其 IC50 為 27 nM。

DAPT 可抑制 Notch 1 信號傳導并誘導細胞分化。

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參考文獻

1. Nick Barker, Peter J Peters, Hans Clevers, et al. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5. Nature. 2007 Oct 25;449(7165):1003-7.
2. Claudia Corrò, Vivian S.W. Li, et al. A brief history of organoids. Am J Physiol Cell Physiol. 2020 Jul 1;319(1):C151-C165.

3. Sara Rahmani, Tohid F. Didar, et al. Intestinal organoids: A new paradigm for engineering intestinal epithelium in vitro. Biomaterials. 2019 Feb;194:195-214.

4. Aliya Fatehullah, Nick Barker, et al. Organoids as an in vitro model of human development and disease.

5. Mo Li, Juan C Izpisua Belmonte. Organoids — Preclinical Models of Human Disease. N Engl J Med. 2019 Feb 7;380(6):569-579.

6. Joseph Azar, Mohamed Al-Sayegh, Wassim Abou-Kheir, et al. The Use of Stem Cell-Derived Organoids in Disease Modeling: An Update. Int J Mol Sci. 2021 Jul 17;22(14):7667.

7. HansClevers. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 2016 Jun 16;165(7):1586-1597.

8. Kathryn L Fair, Jennifer Colquhoun, Nicholas R F Hannan. Intestinal organoids for modelling intestinal development and disease. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 2018 Jul 5;373(1750):20170217.

9. Toshiro Sato, Hans Clevers, et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 2009 May 14;459(7244):262-5.

10. Madeline A Lancaster, Juergen A Knoblich. Organogenesis in a dish: modeling development and disease using organoid technologies. Science. 2014 Jul 18;345(6194):1247125.

11. Mo Li, Juan C Izpisua Belmonte. Organoids - Preclinical Models of Human Disease. N Engl J Med. 2019 Feb 7;380(6):569-579.

12. Mart M Lamers, Hans Clevers, et al. SARS-CoV-2 productively infects human gut enterocytes. Science . 2020 Jul 3;369(6499):50-54.