細胞復蘇技術知識分享
各位老師在進行細胞培養時，肯定會遇到以下問題：
● 細胞越長越多● 買的細胞比較貴重
● 節假日無法照看細胞
● 實驗不順暢需要重新進行實驗
這時，我們就需要適當的保存一些細胞，也就是凍存細胞。
細胞凍存是細胞保存的主要方法之一。
利用凍存技術將細胞置于-196℃液氮中低溫保存，可以使細胞暫時脫離生長狀態而將其細胞特性保存起來，這樣在需要的時候再復蘇細胞用于實驗。而且適度地保存一定量的細胞，可以防止因正在培養的細胞被污染或其他意外事件而使細胞丟種，起到了細胞保種的作用。
放假前我們已經教過大家如何進行細胞凍存，讓大家安心過個好年，那么接下來
您的細胞準備好“開工”了嗎？
細胞凍存復蘇遵循的原則是：慢凍快融慢凍大家可參考之前的文章：
今天我們來聊聊，細胞復蘇時需要注意的那些事兒。細胞復蘇的原則：快速融化必須將凍存在-196℃液氮中的細胞快速融化至37℃，使細胞外凍存時的冰晶迅速融化，避免冰晶緩慢融化時進入細胞形成再結晶，對細胞造成損害。
01、實驗前準備
1. 將水浴鍋提前預熱至37℃2. 細胞實驗室進行常規消毒，用75％酒精擦拭紫外線照射40min的超凈工作臺臺面，保證無菌。
3. 在超凈工作臺中按次序擺放好消過毒的離心管、吸管、培養瓶等即將使用的耗材及試劑。
02、取出凍存管
1. 根據細胞凍存記錄按標簽找到所需細胞的對應編號。2. 從液氮罐中取出細胞盒，取出所需的細胞，同時核對管外的編號。
03、迅速解凍
1. 迅速將凍存管投入到已經預熱的水浴鍋中迅速解凍，并要不斷的搖動，使管中的液體迅速融化。2. 約1-2min后凍存管內液體完全溶解，取出用酒精棉球擦拭凍存管的外壁，再拿入超凈臺內。
04、平衡離心
1. 用架盤天平平衡后，放入離心機中3000r/min 離心3分鐘。05、制備細胞懸液
1. 吸棄上清液。2. 向離心管內加入10ml完全培養液，吹打制成細胞懸液。
3. 用培養液懸液混懸沉淀細胞，調整細胞濃度，放入培養箱中培養。
06、細胞計數
1. 細胞濃度以5×105/ml為宜。07、培養細胞
1. 將復合細胞計數要求的細胞懸液分裝入培養瓶內，將培養瓶放入37℃，5％CO2的培養箱內2-4h（或者24-48h）后換液繼續培養培養，換液的時間根據細胞情況而定。08、記錄復蘇日期
“ Note
注意事項
細胞凍存和復蘇是細胞培養技術里面最容易出現問題的部分，因此我們幫您總結以下幾點注意事項，幫助您更好的進行實驗操作：1. 注意無菌操作。
2. 取細胞的過程中可能會接觸液氮，一定注意帶好防凍手套，護目鏡。
3. ☆此項尤為重要，如果凍存管密封不嚴，細胞凍存管可能漏入液氮，解凍時，在水浴中搖晃，凍存管中的氣溫急劇上升，可導致爆炸，所以，一定要戴保護眼鏡和手套。
4. 應在1-2min內使凍存液完全融化。如果復溫速度太慢，則會造成細胞損傷。另外，細胞復蘇后的操作最好在4℃冰浴中進行，以減少冷凍保護劑對細胞的毒性。
5. 細胞復蘇過程中，升溫的速率要大，把從液氮或-70℃水箱中取出的細胞在最短的時間內放入水浴鍋中進行解凍。
6. 離心前須加入少量培養液。細胞解凍后二甲基亞砜濃度較高，注意加入少量培養液可稀釋其濃度，以減少其對細胞的損傷。
7. 細胞貼壁少的問題：教科書中說明凍存細胞解凍時1ml細胞液要加10ml－15ml培養液，經驗總結，培養基越少細胞越容易貼附。
8. 復蘇細胞分裝的問題：復蘇1管細胞一般根據情況可分裝到1-2只培養瓶中，分裝過多，細胞濃度過低，不利于細胞的貼壁。
9. 加培養基的量放入問題：這個量的多少的把握主要涉及到的問題是DMSO的濃度，從如果加培養基的太少，DMSO的濃度就會比較大，就會影響細胞生長，從以前的資料來看，DMSO的濃度在小于0.5%的時候對一般細胞沒有什么影響。還有一個說法是1％。所以如果凍存液的濃度是10％DMSO，那么加10ml以上的培養基就恰好稀釋到了無害濃度。
初學者易犯錯誤
1. 水浴鍋未提前預熱或者未預熱到37℃直接融化。
2. 水浴鍋內凍存管太多，導致傳熱不佳，使融化時間延長。
3. 離心前忘記平衡，導致離心機損壞和細胞丟失。
4. 一次復蘇細胞種類過多，忘記更換吸頭和吸管，導致細胞交叉污染。
解凍后的細胞要用和以前一樣的培養液和血清。因為每一種細胞都有自己特定的，并且已經熟悉了的生長環境。突然使用不一樣的培養液和血清，會造成細胞生長不良，甚至死亡，像水土不服一樣。
結果分析
判斷細胞復蘇成功與否，需要看復蘇后細胞貼壁率及細胞存活率（細胞存活率將凍存管內剩余的細胞，用臺盼藍染色法檢測復蘇細胞的存活率。呈藍色的細胞為死細胞，活細胞不著色。用細胞計數板和計數器計數細胞，得出細胞存活率）。
如果復蘇后95%以上的細胞貼壁，而且細胞的活性好，這就說明細胞復蘇的過程沒有問題。復蘇的細胞恢復到正常生長，達到正常的生長特性（比如細胞群體倍增時間等）后要再凍存以補充細胞儲存數量。
本文部分內容來源：百度文庫
歡迎關注公眾號留言咨詢，給您最合適的解決方案~
Copyright(C) 1998-2025 生物器材網 電話：021-64166852;13621656896 E-mail：info@bio-equip.com