研究人員在兩個近親家庭中發現了一個常染色體隱性遺傳綜合征。對從 A-IV-4 和 A-IV-5 病人分離的細胞進行全外顯子組測序，結果表明兩名患者UBQLN4 基因外顯子 6 上發生了有害的純合子 c.976C > T 突變。預計這種突變創造了一個過早的終止密碼子(p.R326X)。這些病人顯示出智力障礙，生長遲緩，小頭畸形，面部畸形，聽力喪失，共濟失調和貧血。為了研究 c.976C>T 突變是否影響 UBQLN4 表達，作者進行了免疫印跡檢測。抗體都沒有檢測到來自 B-IV-3 或 A-IV-5 細胞中的 全UBQLN4 蛋白。結果表明，c.976C> T 突變產生了 UBQLN4-無效等位基因，進而產生一種新的純合子常染色體隱性遺傳綜合征，作者把它命名為''UBQLN4缺乏癥候群''。

圖1. UBQLN4 缺乏癥候群的發現

       為了了解 UBQLN4 功能喪失是否影響 DNA 修復動力學，研究人員接下來評估了新抑癌蛋白（NCS）、依托泊苷(etoposide)、順鉑(cisplatin)或 羥基脲(HU)暴露后DMFs 中 DNA 損傷的積累和清除情況。利用全自動免疫熒光顯微鏡來量化核 gH2AX 病灶，該病灶可視為未修復的 DNA 損傷。與野生型對照組相比，在 NCS 和 etoposide 的作用下，研究人員觀察到患者和雜合細胞中 gH2AX 灶的清除明顯延遲。相反的是，與依托泊苷和新抑癌蛋白不同，順鉑和羥基脲處理的細胞在 48 小時的觀察期內 gH2AX 灶持續增加，結果如圖 2 所示。研究表明，UBQLN4 功能喪失會增加細胞對于基因毒性藥物的敏感性。

圖2. UBQLN4 功能喪失對 DNA 修復動力學的影響

      為了探究 UBQLN4 是否會重新定位到 DNA 損傷的位置，研究人員使用微激光照射U2OS 細胞的單個細胞核的方法，來誘導產生局部 DNA 損傷病灶。使用 UBQLN4 特定抗體，結果表明 UBQLN4 的確與 53BP1 結合，被召集到 DNA 損傷區域。為了闡明 UBQLN4 的動力學機制，研究人員表達了異位 GFP，并監測 UBQLN4 對U2OS 細胞激光誘導損傷的補充。結果表明，在損傷誘導后 5 分鐘內，UBQLN4 就被招募到損傷部位(如圖3 所示)。研究人員在實驗過程中發現， UBQLN4 的磷酸化可被 ATM 所介導，而磷酸化的 UBQLN4 對于適當的 DNA 損傷應答 (DNA damage response, DDR) 是必須的。 

圖 3. UBQLN4 被招募到DNA損傷位點

      我們知道，哺乳動物細胞采用兩種主要的 DNA 雙鏈斷裂 (DSB) 修復途徑，即經典的非同源末端連接 (c-NHEJ) 途徑和同源重組修復 (HRR)途徑。研究發現，UBQLN4 是 ATM 的底物，DSB 封鎖過程在 UBQLN4 缺失的細胞中明顯受損。UBQLN4 耗竭顯著增加了 HRR 相對于 NHEJ 在 DSB 修復中的貢獻，而 UBQLN4 過表達則顯著增加了 NHEJ 的作用。

圖4. UBQLN4 的缺失會導致增強同源重組修復途徑的作用

       為了評估 UBQLN4 表達與人類癌癥中的相關性，作者檢查了 498 例神經母細胞瘤病例。與 1 期相比，UBQLN4 mRNA 的表達在 3 期和 4 期神經母細胞瘤中顯著增加。進一步發現高危病例的 UBQLN4 mRNA 水平相比非高危病人顯著增加。鑒于 HRR 缺乏與 PARP1 抑制劑敏感性有關，作者研究了olaparib 對 UBQLN4 過表達 U2OS 細胞和同基因對照的敏感性。UBQLN4 過表達顯著增加 olaparib 靈敏度。作者進一步檢測了UBQLN4 表達水平高 (SY5Y) 或低 (GIMEN) 的神經母細胞瘤細胞系的敏感性。結果發現，與 GIMEN 細胞相比，SY5Y 細胞顯示出明顯高的 olaparib 敏感性。

圖5. UBQLN4 過表達與 PARP1 抑制劑敏感性相關

小M 的小思考：

研究人員從一種復雜的遺傳病中確定了一個純合的 UBQLN4 種系突變，p.R326X。受影響的患者顯示與其他基因組不穩定綜合征相似的癥狀，如共濟失調-毛細血管擴張癥等。研究人員為了闡明其機制，研究發現 UBQLN4 以 ATM 依賴的方式被磷酸化然后被募集到 DNA 損傷部位，在這里它通過功能上壓制 HRR 將 DSB 修復重新定向到 NHEJ 方式。進一步研究表明 UBQLN4 可以與泛素化的 MRE11 互動，促進其蛋白酶體降解。 此外，在 UBQLN4 過度表達的腫瘤細胞中 HRR 使用率降低與 PARP1 抑制劑敏感性相關。本文從生物學角度揭示了一種新的基因組不穩定綜合癥，為 UBQLN4 在調控 DSB 修復途徑的選擇上有作用提供了依據，發現 UBQLN4 過表達可作為預測因子，針對各種對 PARP1 抑制劑敏感性的癌癥實體生存率低。

參考文獻

Jachimowicz RD, et al.UBQLN4 Represses Homologous Recombination andIs Overexpressed in Aggressive Tumors. Cell. 2018 Dec 21. pii:S0092-8674(18)31516-2.

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