神經環路功能解決方案

1、光遺傳系統實現神經環路調控

神經信號調控傳統采用藥物或電刺激方式，前沿的神經調控方式為光遺傳神經調控。光遺傳學結合遺傳學手段選擇性在某類細胞上表達光敏感通道，通過活體組織內光傳送技術，改變這些細胞的活動及功能。該技術利用分子生物學、病毒生物學等手段，將外源光敏感蛋白基因導入活細胞中，在細胞膜結構上表達此光敏蛋白；然后通過特定波長光的照射，光敏蛋白即可激活與關閉，從而控制細胞膜上離子通道的開與關，改變細胞膜電壓的變化進而引起神經元的激活或抑制。
 

因此光遺傳學為精確定位與剖析不同類型神經元在神經環路及神經系統疾病、精神疾病中的作用提供了有力的研究手段。光遺傳刺激系統通過多通道控制器來控制 LED光源，利用光來激活或者抑制特定神經元的活性，可視化地調控和記錄細胞亞群的反應，然后讓細胞將這種反應進行重現，從而明確這一類細胞對行為的功能性作用。運用此技術廣泛用于研究該神經網絡功能，特別適用于在體、甚至清醒動物行為學實驗。
 

光纖記錄系統

光纖記錄系統的目的是實時檢測細胞的活性變化。基于鈣離子濃度變化的熒光成像技術被廣泛用來記錄神經元活性。以 GFP 為例，鈣離子濃度敏感蛋白 GCaMP 通過熒光信號強度變化可以很好地表征神經元的活性，其中 GCaMP6 具有很高的時間靈敏度和熒光信號信噪比。將 GCaMP 表達到神經元中，然后通過光纖激發 GCaMP 的熒光并實時監測記錄熒光信號強度的方法即光纖記錄。 Plexon Photometry 在體光纖記錄系統的激發光目前主要是470nm (GFP)。
 

在體多通道電生理記錄系統

多通道記錄系統主要是通過多通道電極陣列植入到實驗動物頭部，將神經元的胞外高頻的動作電位信號以及記錄電極所在腦區的局部場電位信號實時采集出來，通過多級腦電信號放大，把幾微伏的腦電信號放大到幾伏，然后經過數模轉換，把信號傳輸到計算機中，通過軟件分析所有信號，實現實時分析，為腦中群體神經元編碼、存儲和提取神經信息提供了時間上的同步，也反映了大腦神經網絡信息處理的不同活動模式。所有放大后的腦電信號也可以被記錄下來，然后通過系統中傳感器得到動物體的準確空間位置，并且相關信息與腦電信息被同步后存入計算機。
 

光遺傳、光纖記錄、在體電生理記錄等神經功能調控與記錄技術可以結合使用，全方位采集活體大小鼠在清醒或者其他狀態下的神經功能信息。以下以“光遺傳在體電生理記錄小鼠紋狀體D1中型多棘神經元的活動模式”為例。
 

光遺傳-在體多通道電生理記錄系統,用其對直接通路中型多棘神經元(D1-MSN)的活動模式進行在體記錄。方法:首先向D1-Cre轉基因小鼠紋狀體背外側注射攜帶光敏陽離子通道channelrhodopsin-2(ChR2)基因的腺相關病毒,使ChR2在D1-MSN上通過Cre重組酶的同源重組而特異性表達。之后通過光刺激和電生理記錄相結合的方式在體記錄D1-MSN的活動模式。結果:D1-Cre小鼠紋狀體在注射病毒后通過熒光顯微鏡觀察,可發現明顯的熒光信號,證明病毒正常表達。通過光遺傳-在體多通道光電極記錄系統,本研究成功地在紋狀體內用光刺激誘發了MSN的電活動。通過對記錄的電信號進行數據分析,證明了光刺激誘發的電信號確實來自于D1-MSN,成功地對D1-MSN活動模式進行了在體記錄。結果提示光遺傳-在體多通道光電極記錄系統是一種對紋狀體D1-MSN電活動模式記錄的可選新方法。

神經環路結構解決方案

光透明介觀成像神經環路結構成像：通過神經熒光標記+光透明+光片介觀成像多項前沿技術的聯用可以獲得神經環路的投射和神經胞體定位、分布等神經環路結構信息。

嗜神經病毒標記與轉基因熒光神經標記

嗜神經病毒是一類能感染神經細胞，且能沿神經環路傳播增殖的病毒。利用嗜神經病毒作為示蹤工具，可以實現神經回路跨突觸示蹤及神經元投射示蹤。嗜神經病毒具有高特異、靈敏和靈活地標記和有效地研究神經元網絡，經改造的嗜神經病毒包括腺相關病毒AAV、偽狂犬病毒PRV、狂犬病毒以及其它可感染神經元的慢病毒、逆轉錄病毒、腺病毒和腺相關病毒等。

轉基因熒光標記技術通過轉基因方法可對特異性或非特異性神經元進行熒光標記。轉基因熒光適用于包括果蠅、斑馬魚、小鼠、大鼠、靈長類等在內的各種模式動物，可以研究在正常、疾病及發育過程的各種狀態下的神經環路、神經投射、神經胞體等方面內容。

光透明技術

光透明技術是一種讓生物組織具有光學透明性的新型技術。而正常的生物組織中成分復雜，如蛋白質、脂質和血紅素等物質對光的傳播造成阻礙。光透明技術就是使用一種試劑或幾種試劑組成的混合液通過浸泡、電泳或灌注等處理方式,使大塊組織或完整器官達到視覺下透明或光學儀器下可見的效果。

MACS離體光透明法

通過結合多種熒光標記手段及光片照明成像，MACS方法可以實現小鼠全腦及胚胎的三維神經結構信息的獲取。同時，MACS方法對脂溶性膜染料Dil良好的兼容性，使得其能夠實現正常小鼠腦、脊髓、脾等多種組織器官的三維血管網的重構，以及糖尿病小鼠腎小球病理結構的三維可視化和定量統計分析。MACS所具備的快速透明能力、對包括脂溶性染料在內的多種熒光色團的兼容性及良好的形態保持等優勢，有望為多種組織器官的形態學與病理學研究提供重要的工具。

FDISCO離體光透明法

FDISCO方法結合光片照明成像可以實現小鼠全腦、肌肉、腎臟等多種完整器官的神經與血管成像。由于其優秀的透明及熒光保持能力，FDISCO方法在大體積生物組織透明成像上具有顯著的優勢，并且在透明生物組織的長期重復成像和弱熒光信號成像上具有極大的應用價值。

激光片層掃描成像技術

光片顯微鏡與傳統顯微鏡的不同在于激發光的照明方式。它的照明光是一張與成像面平行的薄薄的“光片”，只有焦平面的樣品被照亮，而其上下的樣品不受影響。

激光片層掃描成像技術優勢：

提高了圖像和背景的反差(Signal-to-Background Ratio) 和軸向分辨率：光片照明技術保證了焦平面上下的樣品不會被激發，具備和共聚焦顯微鏡類似的光學切片功能；

減少了光漂白和光毒性：與傳統的熒光照明技術相比，光毒性可以被降低20-100倍，這樣就能在更接近生理狀態的條件下，對活體生物樣品進行長時間的三維成像；與激光共聚焦和雙光子顯微鏡使用低QE的PMT的點掃描成像相比，光片顯微鏡使用高QE的CCD或sCMOS相機進行面成像，大大提高了成像速度和圖像的信噪比。共聚焦需要幾分鐘甚至幾小時才能拍完的樣品，用光片顯微鏡只需要幾秒到幾分鐘。因此，光片顯微鏡也特別適合用于大樣品成像。

神經結構三維成像方案：

全腦神經示蹤三維成像

全腦神經胞體三維成像

神經環路的功能與結構研究的意義

神經元是神經系統的基本結構和機能單位。大腦由上百億個神經元組成，堪稱人類最復雜的器官。以大腦皮質為例，大腦皮質（即大腦表層）主要由兩類神經細胞構成，一類是興奮性神經細胞，一類是抑制性神經細胞。大腦內的興奮性神經遞質主要是谷氨酸，而抑制性神經遞質主要是γ-氨基丁酸。興奮性和抑制性的動態平衡（E/I balance）是大腦正常功能和可塑性形成和維持的重要基礎，如果這個平衡被打破則會誘發癲癇、帕金森、抑郁癥等多種神經疾病。因此，興奮性突觸和抑制性突觸的相互調控過程至關重要。

通過光遺傳、光纖記錄、在體電生理記錄等神經功能調控與記錄技術可以結合使用，全方位采集活體大小鼠在清醒或者其他狀態下的神經環路功能信息。通過神經熒光標記+光透明+光片介觀成像+全腦大數據處理分析技術聯用，通過神經熒光標記+光透明+光片介觀成像多項前沿技術的聯用可以獲得神經環路的投射和神經胞體定位、分布等神經環路結構信息。

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