在大多數干細胞實驗研究中，誘導分化成骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞已經成為鑒定其分化潛能的金標準。

上期我們分享了成骨誘導分化的操作（點這里回顧），本期輪到成脂誘導分化操作啦！

成脂誘導分化
脂肪組織由脂肪細胞組成，對保持能量和代謝平衡非常重要。脂肪組織有兩種，一種為白色脂肪組織（WAT），主要分布在皮下和內臟，內臟白色脂肪與肥胖、病理驗證和胰島素抵抗相關，皮下白色脂肪則可提高葡萄糖耐受性；另一種為棕色脂肪組織（BAT），主要呈離散狀分布在脊椎旁、鎖骨和腎上腺，功能是產熱。這兩種脂肪組織有相同的分化特征，都是由間充質干細胞分化而來。

體外誘導成脂分化的鑒定
1.檢測成脂誘導后細胞的胞漿中的油滴（脂肪滴）。脂肪滴經油紅O染色后在顯微鏡下呈現顯著的紅色，未分化細胞則無明顯顏色。通過統計各樣品中成脂分化細胞的百分比來對成脂分化強弱加以表征對比。

2.MSC成脂分化后有明顯的成脂特征性基因表達，如LPL、PPARγ等。可使用RT-PCR通過對相關基因表達量的測量，對比不同實驗組別的成脂分化差異。     

OriCell^®人脂肪間充質干細胞成脂誘導分化油紅O染色效果

OriCell^®小鼠脂肪間充質干細胞成脂誘導分化油紅O染色效果

OriCell^®小鼠骨髓間充質干細胞成脂誘導分化油紅O染色效果

實操走起
01 所需材料
1. OriCell^® 間充質干細胞成脂誘導分化試劑盒（套裝內A、B液成分含基礎培養基、優級胎牛血清、成脂誘導添加物；油紅O染色液、明膠）

2. OriCell^® Phosphate-Buffered Saline (1×PBS)（貨號：PBS-10001）

02 誘導分化操作步驟
（注：A、B液配置方法詳見產品說明書）

1.加1mL 0.1%明膠到六孔板中，搖勻，使其能均勻覆蓋各孔底面。

2. 將鋪有0.1%明膠的六孔板放置在超凈臺或CO₂培養箱至少30min。

3. 30min后吸去明膠即可用于接種細胞，或等待六孔板晾干再接種。

4. 將待誘導的間充質干細胞按照 2×10⁴cells/cm²的細胞密度接種于六孔板中，每孔加入2mL普通完全培養基。

5. 細胞置于37℃、5%CO₂、飽和濕度的CO₂培養箱中培養。

6. 當細胞匯合度達到100%時，小心地將孔內完全培養基吸走，向六孔板中加入2mL OriCell^® 間充質干細胞成脂誘導分化培養基A液。

7. 誘導3天后，吸去六孔板中的A液，加入2mL OriCell^® 間充質干細胞成脂誘導分化培養基B液。

8. 維持1天后，吸去B液，換回A液進行誘導。

9. A液和B液交替使用，期間需每天觀察細胞狀態。若在A液誘導過程中出現細胞收縮、死亡的情況，請及時更換為B液，直至細胞狀態恢復。

10.重復誘導和維持過程，直到出現足量、大小適宜的脂滴，即可準備染色。

03 油紅O染色

1.成脂誘導分化結束后，吸去六孔板中的成脂誘導分化完全培養基，用1×PBS輕柔洗滌2~3次。

2. 每孔加入2mL 4%多聚甲醛溶液（或 10%福爾馬林），室溫，固定30min。

3. 按油紅O貯存液：蒸餾水=3：2，配制為工作液。混勻后250×g離心4min，使用上清。

4. 吸去固定液，用1×PBS輕柔洗滌2~3次，確保將固定液清洗徹底。

5. 每孔加入2 mL油紅O染料工作液，室溫染色 30 min。

6. 吸去油紅O染色液，用1×PBS輕柔洗滌2~3 次，充分洗去染色液。

7. 每孔加入2 mL 1×PBS，將培養板置于顯微鏡下觀察成脂染色效果。

8. 染色后的六孔板用封口膜封裝后，置于4℃保存，但不要超過1周。脂滴會相互融合，無法保持染色時的狀態。

注意事項

1、本操作規程以六孔板為例，請根據實際情況選用合適的培養容器；

2、為減少誘導過程細胞漂起、不貼壁，建議使用明膠包被培養容器；

3、誘導培養基在使用前均需預熱至 37℃；

4、A液刺激脂滴形成；B液維持已形成的脂滴，并促進脂滴增大；

5、通常情況下，按照“A液3天，B液1天”的使用方式即可順利誘導細胞成脂；

6、各類、各批次細胞在誘導過程中可能出現多種情況，請靈活調整A、B液的使用比例；

7、為防止脂滴脫落，所有操作盡可能輕緩。

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