外泌體的神秘面紗已經全面揭開，研究熱潮席卷而來。從上游到下游的外泌體相關產品與服務的公司遍地開花，各類國家課題基金申請的外泌體相關中標數量逐年升高，想要從“大蛋糕”里分走一塊嘗嘗鮮，需要把握外泌體的整體研究思路，并針對研究樣本和目的設計合理的外泌體研究方案。2021年接近尾聲，小希給各位全方位的理一理外泌體研究的思路，蹭一蹭外泌體的熱度過個冬！
 

圖1 外泌體研究整體思路

 

外泌體——基礎知識篇

 

細胞外囊泡（Extracellular Vesicles，EVs）是指細胞主動分泌的具有膜結構的微小囊泡的統稱，幾乎所有的細胞都會分泌EVs，然而EVs最初被認為是細胞向外排泄的“垃圾”，是細胞移除碎片和清除特定大分子的一種途徑。根據大小、生物特性和形成過程的不同，EVs主要分為外泌體（exosomes）、微囊泡（microvesicles）、和凋亡小體（apoptotic bodies）三大類。近十年來，研究學者重新認識了EVs的重要性，越來越多的研究發現EVs可以作為遺傳信息的傳遞者，攜帶和傳遞信號分子運輸到相鄰遠處的細胞，從而調節細胞的生理和病理的狀態，參與許多疾病的發生發展過程，其中對于外泌體的研究最為火熱。

 

一、外泌體的樣本來源

由于研究細胞分泌的外泌體，需要避免培養基中其它外源性外泌體對細胞分泌外泌體的影響，目前采用以下方法獲取研究樣本：血清饑餓培養、去外泌體血清培養、無血清體系培養、其它樣本來源。

 

01 血清饑餓培養

一般是指通過降低培養液中的血清濃度，使所培養的細胞因缺乏血清中的生長因子而不能分裂，這個操作常用來做細胞同步化分裂。常規操作就是在細胞培養至融合度為50-60%左右，撤去含血清的完全培養基，更換為基礎培養基進行饑餓培養細胞至融合度為80%左右，收獲細胞上清進行下游的研究。但血清饑餓培養收獲的外泌體量有限且質量較低。

 

02 去外泌體血清培養

為了減少或避免血清饑餓培養對細胞分泌外泌體的影響，去外泌體血清培養細胞成為大多數學者選擇的一種方式。去外泌體血清可適用于大部分細胞培養，基本可維持與正常胎牛血清中相同生長速率和形態。在使用各種方法去除胎牛血清中大部分的外泌體后添加至培養基中配制成去外泌體血清完全培養基，應用于細胞外泌體的研究。

 

03  無血清體系培養

 

從饑餓培養到去外泌體血清培養，再到無血清體系培養。這是針對外泌體研究所做出的培養基改善與優化。也讓學者們能夠了解到細胞培養所需要的營養成分。目前無血清體系的培養基可分為含血小板裂解物（含外泌體）的無血清培養基、配方明確的無血清培養基等，其中配方明確的無血清體系讓研究細胞外泌體的結果更加準確。

 

 

 

除了細胞來源的外泌體樣本研究最為廣泛，血漿、血清也是多數學者的研究樣本，其它的樣本包括唾液、腦脊液、乳汁、尿液等生物體液，均可以作為外泌體研究的樣本來源。

 

二、外泌體的富集

 

目前采用2D培養方式收獲大量細胞上清的學者占多數。這種方式收獲的細胞上清中顆粒濃度低，樣本體積大，后續的純化成本、人力、物力消耗大。但對于基礎研究，基本2D培養方式獲得的外泌體樣本量就可以滿足。另外需要考慮的是不同細胞培養方式可以刺激細胞產生不同表征或內含物的外泌體。所以3D培養方式通過模擬體內環境讓細胞更好地伸展，正確表達或分泌的外泌體量較2D培養方式要更多。各類的生物反應器（例如FiberCell系統等）或細胞外基質涌現在大眾面前，可根據實際研究需要選擇合適的設備或試劑進行外泌體的富集。

 

 

三、外泌體的提取/純化

 

作為新興研究領域，外泌體研究的技術方法正在走向標準化。國際細胞外囊泡學會（ISEV）分別在2014年和2018年發表了EVs的研究方法與質控標準。但如何獲得高質量的外泌體樣本一直是外泌體相關基礎研究和臨床應用的瓶頸問題之一。目前已經報道的外泌體提取/純化的方法包括：超速離心法、超濾法、尺寸排阻色譜法、沉淀法、免疫親和分離法（免疫磁珠法、微流控技術）等。不同提取方法獲得的外泌體質量不一，且結果可能不可重復。總之，沒有單一的提取方法適合所有外泌體的研究目的，組合的外泌體提取/純化方法逐漸成為一種趨勢。正確獲得高質量的外泌體，提高實驗研究的準確性和可靠性。可根據實驗研究樣本類型與體積選擇合適的提取方法獲取高質量的外泌體樣本。

圖2 尺寸排阻色譜法原理示意圖

 

四、外泌體的特征鑒定

 

根據ISEV在2014年發表的指導手冊（MISEV），對于獲得的外泌體樣本需要做以下鑒定：

• 納米顆粒示蹤分析（NTA）：觀察樣本中外泌體的粒徑和濃度情況；

• 透射電鏡（TEM）：觀察外泌體的形態特征；

• 蛋白免疫印跡實驗（WB）：鑒定外泌體的表面標志蛋白表達情況。

圖3  NTA檢測結果（左一），TEM檢測結果（中），WB檢測結果（右一）

 

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五、外泌體的下游分析

 

經過上面的檢測可對外泌體驗明正身，就可以在蛋白水平和核酸水平對其進行深入分析。外泌體攜帶大量功能性的miRNA、少量mRNA、IncRNA，以及特異性的蛋白質（例如細胞因子、生長因子）等生物活性物質，用于參與細胞之間通訊、細胞遷移、參與各種疾病的過程等。不同細胞來源的外泌體所含的蛋白成分和RNA不太相同，可作為多種疾病的早期診斷標記物，也能作為靶向藥物的載體進行疾病治療。

 

目前外泌體的下游分析包括：

• 外泌體高通量測序：研究方向為表達譜、分子標志物、分子機制等。包括miRNA測序、mRNA測序、IncRNA測序、cicRNA測序。

   

圖4 外泌體高通量測序-差異分析圖

 

• 外泌體蛋白組學分析：研究方向為疾病發病機制、疾病診斷和預后的生物標志物、篩選疾病治療靶點等。包括定性技術（Shotgun）、定量技術（TMT/iTRAQ/Label Free/DIA）、修飾技術（磷酸化、糖基化、乙酸化、泛素化）。

圖5 外泌體蛋白組學分析-韋恩圖

 

 

• 外泌體標記/示蹤：研究方向為外泌體的體內生物分布、生理功能、遷移和靶向機制等。包括磁成像示蹤（MRI）、計算機斷層掃描示蹤（CT）、核成像示蹤、光聲成像示蹤、熒光成像示蹤（親脂性染料標記、慢病毒標記）、生物發光成像示蹤（BLI，熒光素酶-底物反應）。

• 外泌體功能鑒定：研究方向為外泌體參與細胞共培養、細胞遷移與侵襲、細胞凋亡等，以及動物體內注射后表型變化和其它指標檢測。

• 外泌體臨床研究：研究方向為藥物遞送載體、早期臨床診斷、各類疾病治療、醫美領域等。

 

 

外泌體研究除了必備的“硬件”操作技術與檢測設備，同樣具有“軟件”的數據庫知識供全球外泌體研究學者參考。今天就給大家列舉8大外泌體數據庫，為您的外泌體研究增添靈感。

01  ExoCarta——外泌體蛋白質、RNA和脂質數據庫

ExoCarta是首個外泌體標志物綜合數據庫，由Simpson教授團隊建立，具有外泌體蛋白動態的蛋白與蛋白之間相互關系網及生物學通路。用戶可從大量研究中下載最常用的蛋白數據。

 

02 exoRBase——人體液外泌體長鏈RNA-Seq數據庫

exoRBase數據庫收集和描述人類體液中所有長鏈RNA，目前包含19643 個mRNA、15645個IncRNA和79084個cicrRNA，提供注釋、表達水平和可能的來源組織。

 

03 EVmiRNA——miRNA數據庫

一種EVs的miRNA數據庫，收錄了17種器官或疾病的462個sRNA測序數據集，包括miRNA表達譜、miRNA調節途徑、miRNA函數、miRNA相關藥物及相關文獻，為EVs的miRNA研究提供重要資源。

 

04 EVpedia——外泌體蛋白質組、轉錄組和脂質體數據庫

EVpedia是由韓國項浦大學創建的一個完整而全面的蛋白質組、轉錄組和脂質體數據庫，其來源包括原核和真核生物。這個免費的數據庫可以作為EVs研究進展的一個基本資料庫，有助于闡明EVs的新功能。

 

05 Vesiclepedia——外泌體蛋白質、RNA和脂質數據庫

Vesiclepedia數據庫是公開的，允許用戶根據不同的搜索標準查詢和下載EV cargo、EV分離和表征模式，生物物理和分子特性以及EV-METRIC，幫助生物醫學科學家評估EV制劑的質量，獲得相應的數據。

 

06  EMBL-EBI——外泌體蛋白GO功能分析數據庫

EMBL-EBI即為歐洲生物信息學研究所，擁有世界上最全面的免費和最新的分子數據資源。該數據庫與ExoCarta和Vesiclepedia緊密合作，識別用于聚焦注釋的靶蛋白以及外泌體實驗方法學的注釋。

 

07 EV-TRACK——外泌體相關文獻數據庫

EV-TRACK是以大牛Thery為首的EV-TRACK聯盟建立的EVs研究透明報告在線數據庫，其中包括EVs相關文獻的方法學參數，基于MISEV評估EVs分離及鑒定相關參數。便于提高外泌體實驗研究的規范性和結果的可靠性。

 

08 Urinary Exosome Protein Database——尿液外泌體蛋白質數據庫

這個尿液外泌體蛋白質數據庫是基于上皮系統生物實驗室（ESBL）已發表的蛋白質質譜數據建立的數據庫。所有數據均來源于健康志愿者的尿液外泌體，這個數據庫包含了用兩種不同的質譜儀來鑒定人類尿液外泌體的蛋白質。

外泌體——參考文獻篇

對于科研工作者來說，想要快速get某個領域的基礎或關鍵信息，莫過于閱讀該領域最權威、最全面的文獻綜述了。外泌體的重要性決定了它可以在很多研究領域站住腳，文章就是最直接的體現。小希為外泌體研究工作者整理了8篇必讀文獻和不同研究領域內可接收外泌體相關研究發表的雜志，讓您充分地了解到外泌體就在身邊，就在眼前。

• “Exosomes: composition, biogenesis and function.” 【Nat Rev Immunol】

 

上榜理由：這篇文獻是外泌體領域大牛Thery發表的最早、較為全面的外泌體綜述。描述了外泌體的物理性質，總結了外泌體的生物學效應及其作用。

 

• “Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends.” 【J Cell Biol】

   

上榜理由：這篇文獻作者是Raposo，同樣是外泌體領域大牛。相對較早、較全面的闡述了EVs的特性和形成過程極其功能的相關機制。

 

• “lsolation and charaterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.” 【Current Protocols in Cell Biology】

 

上榜理由：這是大牛Thery的另一篇關于外泌體分離提取鑒定的最原始、最權威的文獻。詳細描述了不同樣本來源的外泌體分離提取方法，且對外泌體制劑進行評價。

 

• “Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles.”【Annu Rev Cell Dev Biol】

 

上榜理由：這是Thery和Raposo兩位大牛的合作。詳細闡述了外泌體的生物發生、分泌及其后續的功能等。配圖非常值得保存學習！

 

• “Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions.” 【J Extracellular Vesicles】

 

上榜理由：本文作者由來自57個不同工作單位的61位大佬組成，參考的文獻數量為175篇，文章內容全面。綜合描述了各種組織和體液中EVs的內含物和功能，以及不同生物與植物中EVs的生理機制。值得大家下載打印出來細讀。

 

• “Exosomes：Vesicles of Intercellular Signaling, Biomarkers, and Vectors of Cell Therapy.” 【Annu Rev Physiol】

 

上榜理由：外泌體不僅內含物豐富，同樣可以作為載體運輸大量的蛋白質、脂質和核酸等，進而改變細胞和器官的功能。本文著重于介紹外泌體作為干細胞治療載體的潛力。

 

• “New Technologies for Analysis of Extracellular Vesicles.” 【Chemical reviews】

 

上榜理由：這篇雜志的影響因子高達47.928分，更是全面總結了細胞外囊泡的研究方法及其臨床應用，參考文獻近300篇，各種配圖十分詳細。又是一篇值得打印出來細讀的文獻。

 

• “Communication by Extracellular Vesicles: Where We Are and Where We Need to Go.” 【Cell】

 

上榜理由：看到Cell，文章必然厲害，再看作者又是大牛Thery，必須細品。本文主要關注外泌體與腫瘤細胞的微環境之間的關系，這層關系同樣適用于EVs介導的其它生理過程。

 

 

以上大牛們的文獻是否能夠滿足您對外泌體的基礎了解呢？是否已經摩拳擦掌準備做實驗發表文章了？

 

 

結語

外泌體，一個新型的研究熱點，已然成為生命科學領域的“寵兒”。在精準醫學與疾病診斷治療的進程中，外泌體將釋放無窮無盡的力量。

這一年，我們依然口罩蔽體；這一年，我們依靠磅礴力量；這一年，我們依舊風雨兼程為生活。

下一年，我們仍會戴好口罩；下一年，我們仍舊砥礪前行；下一年，我們仍要擼起袖子加油干。

 

 

參考文獻

 

• Kalluri R, LeBleu VS. The biology, function, and biomedical applications of exosomes[J]. Science. 2020, 367(6478): eaau6977.

• Stam J, Bartel S, Bischoff R, et al. Isolation of extracellular vesicles with combined enrichment methods. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 2021, 1169: 122604.

• Gobin J, Muradia G, Mehic J, et al. Hollow-fiber bioreactor production of extracellular vesicles from human bone marrow mesenchymal stromal cells yields nanovesicles that mirrors the immuno-modulatory antigenic signature of the producer cell. Stem Cell Res Ther. 2021, 12(1): 127.