_{活細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)是了解動(dòng)態(tài)過(guò)程的關(guān)鍵。這類實(shí)驗(yàn)使我們能夠觀察記錄活體狀態(tài)下的細(xì)胞，而不會(huì)可能因固定或終止不同活體過(guò)程而產(chǎn)生干擾性偽影。}

通過(guò)活細(xì)胞成像可以觀察細(xì)胞、組織或整個(gè)生物體在其自然環(huán)境中的動(dòng)態(tài)過(guò)程，而不僅僅是獲得終點(diǎn)圖像和數(shù)據(jù)。例如，您可以研究細(xì)胞或蛋白質(zhì)的共定位，以查看不同的靶點(diǎn)是否彼此相鄰，并觀察它們?nèi)绾蜗嗷プ饔谩?/span>

<sub>為什么使用多個(gè)熒光標(biāo)記很重要？在活細(xì)胞顯微成像中使用多通道方法可以同步觀察多個(gè)細(xì)胞結(jié)構(gòu)和過(guò)程，提供生理學(xué)方面更重要的結(jié)果，從而為測(cè)量數(shù)據(jù)增加相關(guān)信息。通過(guò)這種方法可以研究細(xì)胞與蛋白質(zhì)相互作用、動(dòng)態(tài)變化以及這些變化如何相互作用和影響。不過(guò)，使用單個(gè)熒光團(tuán)的實(shí)驗(yàn)很常見(jiàn)，而使用兩個(gè)或多個(gè)熒光探針對(duì)活細(xì)胞成像可能會(huì)很復(fù)雜，并且必須仔細(xì)考慮幾個(gè)要點(diǎn)才能成功。本文將介紹有關(guān)成功設(shè)置多色活細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的一些關(guān)鍵方面。

選擇合適的熒光團(tuán)設(shè)置多色活細(xì)胞實(shí)驗(yàn)時(shí)，首先要選擇合適的熒光團(tuán)，這一點(diǎn)至關(guān)重要。熒光團(tuán)必須與活體樣本相容，并具有光穩(wěn)定性，才能進(jìn)行長(zhǎng)期成像。熒光蛋白標(biāo)記、活細(xì)胞染料、動(dòng)態(tài)標(biāo)記（如 Ca2+ 指示劑）及其他用于標(biāo)記感興趣靶標(biāo)的方法是達(dá)到這類目的的合適工具。但是，由于發(fā)射光譜寬，以多通道方式研究活細(xì)胞過(guò)程時(shí)可供選擇的熒光染料仍然相當(dāng)有限。每使用一個(gè)額外的標(biāo)簽，找到具有高特異性和高信號(hào)輸出的激發(fā)/探測(cè)模式就變得更加困難。將兩個(gè)或多個(gè)熒光團(tuán)信號(hào)一起成像時(shí)，需要使用復(fù)雜的標(biāo)記策略最大程度減少光譜重疊。

在生理?xiàng)l件下成像無(wú)論使用細(xì)胞培養(yǎng)物、類器官、球狀體還是較小的模式生物，都必須使用近生理?xiàng)l件來(lái)確保樣本保持活力。在延時(shí)實(shí)驗(yàn)中，某些條件必須保持最佳狀態(tài)，才能確保細(xì)胞不僅能夠存活，而且不會(huì)承受壓力，并保持真實(shí)的生理機(jī)能。通常情況下使用培養(yǎng)箱（37°C、二氧化碳、濕度，有時(shí)還包括在一段時(shí)間內(nèi)具有高穩(wěn)定性的氧氣）確保持續(xù)提供近生理?xiàng)l件。此外，選擇一種低自發(fā)熒光、不會(huì)干擾信號(hào)且不影響成像的介質(zhì)也大有好處。</sub>
 

<sub>視頻：RPE 細(xì)胞分裂的 12 小時(shí)共聚焦延時(shí)視頻，細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá) eGFP-tubulin（青色）和 iRFP-Histone H2B（品紅色）。由美國(guó)巴爾的摩約翰霍普金斯醫(yī)學(xué)院荷蘭實(shí)驗(yàn)室 C. Gliech 提供。荷蘭實(shí)驗(yàn)室致力于研究各種控制染色體精確分布的分子機(jī)制，以及有絲分裂錯(cuò)誤在人體健康和疾病中起到的作用。

圖像采集注意事項(xiàng)寬場(chǎng)顯微成像通常是活細(xì)胞成像的首選，因?yàn)樗�能夠更快、更溫和地成像。最先進(jìn)的寬場(chǎng)顯微成像使用 LED 光源和濾光片組。盡管有很多濾光片都可以用于各種不同的熒光團(tuán)組合，但是為了獲得用多個(gè)熒光團(tuán)標(biāo)記的樣本的正確圖像，需要考慮多個(gè)因素。

大多數(shù)用于活細(xì)胞成像的熒光團(tuán)都具有寬發(fā)射光譜。這一事實(shí)通常意味著各個(gè)探測(cè)通道之間會(huì)出現(xiàn)串?dāng)_現(xiàn)象，例如，您會(huì)在紅色探測(cè)通道中看到來(lái)自綠色通道的一些發(fā)射光。在活細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)中使用多個(gè)標(biāo)記時(shí)，熒光光譜重疊現(xiàn)象很常見(jiàn)，因此為了確保看到想識(shí)別的細(xì)節(jié)，可以使用窄帶濾光片。但是，這種方法會(huì)導(dǎo)致靈敏度下降并影響結(jié)果，因?yàn)榛罴?xì)胞中的熒光團(tuán)信號(hào)水平通常較低，尤其是對(duì)于靶標(biāo)豐度稀疏的樣本或以內(nèi)源性水平表達(dá)的樣本。使用更多激發(fā)光來(lái)抵消靈敏度下降通常不可行，因?yàn)檫@種方法對(duì)樣本的危害性會(huì)增加（即光毒性增加）。

在活細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，高速采集通常至關(guān)重要，特別是在研究快速動(dòng)態(tài)過(guò)程時(shí)，如囊泡 觀察。 使用濾光片會(huì)導(dǎo)致速度受限，因?yàn)樵诟淖兠糠N顏色的濾光片組時(shí)必須依次成像。按順序采集圖像比同時(shí)采集圖像需要更多時(shí)間，因此在采集過(guò)程中可能會(huì)錯(cuò)過(guò)樣本的快速運(yùn)動(dòng)，因?yàn)閺囊粋�(gè)圖像到下一個(gè)圖像時(shí)每種顏色都有更長(zhǎng)的時(shí)間間隔。 此外，當(dāng) 兩種或多種顏色之間的直接比較 至關(guān)重要時(shí)，例如在 上述 囊泡 觀察 實(shí)驗(yàn)中： 信號(hào) 甚至可能 在兩次 熒光團(tuán) 采集之間已經(jīng)移動(dòng)， 從而加大數(shù)據(jù)解釋的難度。

改善活細(xì)胞成像的替代方案研究活細(xì)胞中多個(gè)探針之間的相互作用而獲得的大量信息可提供生理學(xué)方面更重要的結(jié)果，因此人們開(kāi)發(fā)了多種方法來(lái)拆分復(fù)雜的混合發(fā)射光信號(hào)。

為了能夠使用多個(gè)標(biāo)簽，以便從一個(gè)樣本中獲得更深入的認(rèn)識(shí)，您可以使用光譜圖像信息線性拆分方法，它可以分析每個(gè)熒光團(tuán)對(duì)總信號(hào)的貢獻(xiàn)。要進(jìn)行線性光譜拆分，必須為所有可能的參考光譜混合方式計(jì)算未知光譜與參考光譜之間的最小差值 (1)。這種方法通常用于對(duì)多種顏色成像，即使它們重疊。但是在寬場(chǎng)顯微成像中，您仍可能遺漏關(guān)鍵信息，因?yàn)楸仨殞?duì)樣本中每個(gè)熒光團(tuán)依次成像，這會(huì)導(dǎo)致速度受限。

如果采用其他方法會(huì)怎樣？有一種方法可以快速拆分多種顏色，而不必?fù)?dān)心采集期間光譜重疊，也無(wú)需學(xué)習(xí)復(fù)雜的光譜拆分方法。

最近發(fā)表的一些文章介紹了一種基于相量的光譜拆分方法 (2, 3)。光譜相量分析可將每個(gè)像素的光譜成分轉(zhuǎn)換為二維圖中的一個(gè)位置。這樣就可以利用簡(jiǎn)單的數(shù)學(xué)方法即時(shí)、可靠地分離不同染料的發(fā)射光。此外，它還可以僅基于光譜而不是強(qiáng)度來(lái)增加濾光——從而保留圖像的細(xì)微細(xì)節(jié)，同時(shí)減少可能會(huì)影響線性光譜拆分的噪聲。由于實(shí)際上消除了串?dāng)_以及自發(fā)熒光等干擾因素，選擇合適的熒光探針組合不再是問(wèn)題，因此以這種方式成像可以更輕松地設(shè)置多通道活細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)。</sub>