很多老師在進行細胞培養實驗時，細胞總是會莫名其妙的就被污染了，同樣的實驗人員，同樣的環境，同樣的培養體系，可是細胞還是有污染。
試劑、耗材已經使用控制變量法進行過排查，那么還有什么方面可能會導致污染呢？

 ———— 細胞房環境污染（空氣中的沉降菌）

 

Vol.1
有關沉降菌的術語與定義

沉降菌
通過使用專門的培養基，并按照以下標準提及的方法，收集空氣中的活微生物粒子，在適宜的條件下，繁殖到肉眼可見的菌落數。通過自然沉降原理收集在空氣中的生物粒子于培養基平皿，經若干時間，在適宜的條件下讓其繁殖到可見的菌落進行計數，以平板培養皿中的菌落數來判定潔凈環境內的活微生物數，并以此來評定潔凈室（區）的潔凈度。

沉降菌菌落數
規定時間內每個平板培養皿收集到空氣中沉降菌的數目，以個/皿表示。

靜態a
潔凈室（區）在凈化空氣調節系統已安裝完畢且功能完備的情況下，生產工藝設備已安裝、潔凈室（區）內沒有生產人員的狀態。

靜態b
潔凈室（區）在生產操作全部結束，生產操作人員撤離現場并經過20min 自凈后。

動態
潔凈室（區）已處于正常生產狀態，設備在指定的方式下進行，并且有指定的人員按照規范操作。

標準：
1. GB/T 16292-2010 《醫藥工業潔凈室（區）》懸浮粒子的測試方法》
2. GB/T 16294-2010 《醫藥工業潔凈室（區）》沉降菌的測試方法》
 

Vol.2
如何進行檢測

1. 實驗準備
試劑：大豆酪蛋白瓊脂培養基（TSA）

圖1. 大豆酪蛋白瓊脂培養基

注：常規超凈臺或安全柜潔凈度級別：100級；常規細胞房潔凈度級別：10000級

布置要求：
采樣點布置宜力求均勻，避免采樣點在局部區域過于稀疏；細胞房、安全柜、超凈臺建議下列布置圖：

圖2.平面采樣點布置圖

參照醫藥工業潔凈室沉降菌的測試方法細胞房、安全柜、超凈臺建議布置圖中，我們選取五點取樣法。（大家可根據實驗室情況進行選擇，具體沒有規定限制取樣布置圖）

圖3. 生物安全柜布置圖
 

最小培養皿數：

注：常規超凈臺或安全柜潔凈度級別：100級；常規細胞房潔凈度級別：10000級；這里的最小培養皿數是所有采樣點皿數總和。

3. 生物安全柜、細胞房及開放環境測試步驟
 

生物安全柜

① 選擇狀態：
●  靜態a測試時：生物安全柜應開機運行不少于10min；細胞房凈化空氣調節系統正常運行時間不少于30min后開始。 
●  靜態b測試時：生物安全柜宜在操作人員撤離現場并經過10min自凈后開始；細胞房宜在操作人員撤離現場并經過20min自凈后開始。
●  動態測試：則須記錄生產開始的時間以及測試時間。

圖4. 桌面

圖5. 離心機

圖6. 顯微鏡
 

圖7. 培養箱
 

圖8. 傳遞窗

開放環境

圖9. 開放環境桌面放置
 

④ 全部采樣結束后，收樣時需從外到里逐個蓋上培養皿蓋（同樣避免人衣物上微生物的掉落干擾實驗），做好相應標記后將培養皿倒置于37℃恒溫培養箱中培養，培養時間不少于48h。
⑤ 每批培養基應有對照試驗，檢查培養基本身是否污染。可選定每批3只培養皿不打開作對照培養。

4. 陽性對照測試
為避免無陽性對照，我們邀請技術同事將手指點涂在培養基上進行陽性對照實驗。兩天后可明顯觀察到菌落的生成。

圖10. 手指部位陽性對照組


圖11. 手指部位陽性對照組（放大圖）

肉眼可以觀察到明顯的菌落形成，成片的是菌落重疊生長聚集在了一起，很難分辨出具體有多少個菌落。
※  平時我們的手上會攜帶大量的菌

Vol.3
測試結果判定

可直接觀察：

圖12. 批次對照組

由圖可以看出對照組都未長菌。




圖13. 生物安全柜污染點取樣
可以看出生物安全柜無污染。



圖14. 細胞房以污染點取樣

由圖可以看出我公司細胞房內潔凈程度達標，無污染。

圖15. 開放環境桌面取樣
開放環境下，肉眼可以看到有菌落形成
 

菌落計數：
●  用肉眼對培養基上的所有菌落直接計數、標記或在菌落計數器上點計，然后用5～10倍放大鏡檢查，有否遺漏。
●  若培養皿上有2個或2個以上菌落重疊，可分辨時仍以2個或2個以上的菌落計數。
●  平均菌落的計算，如下：

 平均菌落數M=（M1+M2+...Mn）/n

 

注：a為培養皿暴露時間不超過4h，以平均菌落數表示
常規超凈臺或安全柜潔凈度級別：100級；常規細胞房潔凈度級別：10000級


Vol.4
注意事項及監測頻率

注意事項：
★  測試用具要做滅菌處理，以確保測試的可靠性、正確性
★  采取一切措施防止人為對樣本的污染。
★  對培養基、培養條件及其他參數作詳細的記錄。
★  由于細菌種類繁多，差別甚大，計數時一般用透射光于培養皿背面或正面仔細觀察，不要漏計培養皿邊緣生長的菌落，并須注意細菌菌落與培養基沉淀物的區別，必要時用顯微鏡鑒別。
★  采樣前應仔細檢查每個培養皿的質量，如發現變質、破損或污染的應剔除。
★  沉降菌檢測使用的大豆酪蛋白瓊脂培養基不一定適養支原體，所以不代表無支原體污染。

監測頻率：
★  如果生物安全柜所處的環境為十萬級潔凈區，可每三個月測試一次;
★  如果生物安全柜所處的環境為萬級潔凈區，至少每個月監測一次沉降菌;
★  如果沉降菌連續幾次監測不合格，則考慮更換生物安全柜的高效過濾器。
 

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