心肌纖維化是多種病理因素導致的心肌細胞及心肌間質的改變，可造成心臟收縮和舒張功能障礙，引起心肌功能、代謝等異常，是常見心血管疾病發生發展到某一階段的主要病理表現。

研究表明心臟纖維化與心肌成纖維細胞（CFbs）密切相關， CFbs在心臟損傷反應中發揮著重要作用，但由于遺傳背景多樣性和心臟成纖維細胞的異質性阻礙了CFbs對調節心臟纖維化的分子機制的研究。

2018年發表在頂級心血管雜志Circulation上的文獻Genetic Regulation of Fibroblast Activation and Proliferation in Cardiac Fibrosis，作者采用雜交小鼠多樣性組(HMDP)來探究遺傳多樣性的心肌成纖維細胞及其在纖維化中的作用，揭示了遺傳背景特異性會影響心功能障礙和病理性纖維化的發展進程，并驗證心肌成纖維化細胞的激活對于心肌纖維化程度的貢獻，同時發現了心肌纖維化的潛在標記基因。

異丙腎上腺素(isoproterol, ISO)是一種非選擇性-腎上腺素能激動劑，被廣泛用于誘發小鼠心臟損傷、心肌肥大、纖維化等模型。之前的研究表明，異丙腎上腺素處理后的雜交小鼠多樣性組各品系間的心臟病理生理學和纖維化表現出顯著性差異。基于這種差異性，本文作者選擇了三種具有代表性的小鼠品系:C57BL/6J、C3H/HeJ和KK/HIJ（它們分別在ISO處理后表現出輕度、中度和最嚴重的心肌纖維化（圖1A））進行研究，通過腹腔植入緩釋泵進行ISO慢性給藥，ISO劑量30mg/kg /d，持續21天構建心肌纖維化模型。
 

RWD 植入式緩釋泵
通過滲透泵釋放ISO已是常用的造模手段，此方式構建的慢性心肌纖維化模型具備穩定、重復性好的特點，可模擬人類晚期心力衰竭的病理特征。

1、一次埋置操作，可實現最長4周持續給藥

2、給藥速率穩定，保證每日給藥量一致

3、泵體體積小，減少對動物自由活動的影響

4、減少頻繁處理動物帶來的應激刺激

作者首先對這三種不同遺傳背景的小鼠進行ISO誘導后的心功能和纖維化的病理分析，心臟組織切片Masson三色染色顯示，ISO處理后，C3H/HeJ和KK/HlJ品系小鼠心臟均表現出清晰的纖維化區域(藍色)，而C57BL/6J心肌纖維化面積最小（圖1B），進一步的功能超聲心動圖分析顯示C3H/HeJ和KK/HlJ品系的射血分數（EF）顯著降低，相比之下，ISO處理的C57BL/6J小鼠心功能基本沒受到損害（圖1D），實驗結果證實了慢性ISO刺激不同品系小鼠會導致不同程度的心肌纖維化。
 

圖1. ISO處理后不同品系(C57BL/6J, C3H/HeJ, KK/HIJ)的心肌纖維化程度不同

基于上述三種品系所表現出的不同程度的纖維化模式，作者接下來通過體內外實驗重點研究不同品系小鼠的心肌成纖維細胞在心肌纖維化模式中的潛在作用。首先是體外細胞實驗，從三種品系小鼠得到的原代心肌成纖維細胞經過分選，擴增，傳代，并暴露于ISO 72小時之后，作者試圖確定這三種品系小鼠的CFbs是否表現出類似的激活和增殖模式。膠原蛋白1 (Col1)、α-平滑肌肌動蛋白(αSMA)和磷酸化組蛋白H3 (pHH3)分別用于心肌纖維細胞、細胞活化和增殖的標記。細胞染色可以發現ISO處理后，來自C3H/HeJ和KK/HlJ這兩個品系的CFbs有很大比率共表達αSMA和Col1，而來自C57BL/6J 的CFbs的αSMA表達量最小，pHH3的細胞染色則顯示三種品系的CFbs增殖水平類似（圖2B、C、E）。這些體外實驗數據表明，CFbs以小鼠品系特異性的方式響應ISO，ISO處理不同品系的CFbs會導致不同的激活水平，但品系間CFbs的增殖水平沒有顯著性差異。
 

圖2. 體外ISO處理后小鼠品系的特異性影響CFbs的激活和增殖方式

作者接著進行體內實驗驗證，免疫組織化學染色結果表明，ISO處理后，許多Col1+細胞在C3H/HeJ和KK/HlJ心肌的血管周和間質區共表達αSMA，并且CFbs激活水平與各品系小鼠的纖維化程度相對應（圖3A、B）；采用BrdU染色標記增殖細胞，在ISO處理后，可以觀察到血管周圍和間質中BrdU+/CFbs細胞的數量顯著增加，且三種品系增殖的數量相近，具備相似的CFbs增殖模式（圖3D、E），與體外結果一致。以上體內外實驗結果表明，心肌病理纖維化程度直接與CFbs的活化水平相關，而不是CFbs增殖水平有關。
 

圖3. 體內ISO處理后小鼠品系的特異性影響CFbs的激活和增殖方式

為了進一步闡述CFbs對于纖維化的內在機制，作者接下來對經ISO處理的這三種品系小鼠的CFbs進行轉錄組測序。從差異基因表達的熱圖數據（圖4A）可以看出ISO對各品系小鼠的CFbs轉錄組的影響是獨特的。另外，對比心肌纖維化以及增殖相關的基因可以發現，KK/HIJ品系中CFbs的激活和纖維化相關的基因與C3H/HeJ和C57BL/6J 品系相比高度上調（圖4B），而這三個品系中與細胞周期和增殖相關的基因的表達水平相似（圖4C）。以上結果進一步驗證心肌纖維化進程中CFBs的激活和增殖不是相互包容的，CFbs增殖可能是CFbs激活的獨立反應，不應將CFbs的增殖作為心臟纖維化程度的測量標準。
 

圖4. ISO處理可誘導不同品系小鼠CFbs的特異基因表達模式

最后，作者試圖在不同遺傳背景的小鼠品系中識別出與纖維化相關的共有特定基因作為纖維化的標志物。作者聚焦于ISO處理后每個品系都上調的基因，可以觀察到絕大多數上調的基因對每個品系都是獨特，而三者共同上調的重疊基因僅有9個（圖5A），并最終鎖定其中的LTBP2（圖5B）。作者對LTBP2進行RT-qPCR實驗證實了其與轉錄組測序數據相同的增長趨勢（圖5C）。同時為了進一步證實LTBP2蛋白在纖維化中存在，對ISO處理后的心臟切片進行免疫組化，可以觀察到 LTBP2與成纖維細胞標記物DDR2和αSMA共同定位，LTBP2的表達特異性地定位于纖維化區域，即使在心肌纖維化程度最小的C57BL/6J小鼠中也是如此（圖5D）。實驗結果提示LTBP2的表達可能指示了心肌纖維化的發展，但其在纖維化中的具體作用還有待進一步研究。
 

圖5. 所有品系小鼠心肌纖維化后CFbs中的Ltbp2均上調

總之，本研究作者通過使用多個近交系小鼠品系來描述CFbs及其對ISO處理后的反應，強調了遺傳背景特異性對于心肌纖維化的重要性。體內外實驗表明CFbs的激活，而不是增殖，與心肌纖維化嚴重程度密切相關。此外，通過比較多個品系的CFbs轉錄組，作者確定了LTBP2基因作為纖維化的標志物，該基因與心肌纖維化密切相關，并指出可將其及其信號通路作為心肌纖維化的潛在治療靶點。