轉移性乳腺癌NIR-II光聲成像和光熱治療的分子工程方酸納米探針應用

瀏覽次數：1259　發布日期：2021-10-27　來源：恒光智影

本文要點：各種方酸染料已被開發用于生物成像。然而，由于缺乏一種簡單、通用的設計策略，在第二窗口(近紅外Ⅱ 1000−1700 nm)發射的方酸染料的研究報道很少，在這篇文章中，探索了分子工程策略來開發具有NIR-II發射的方酸染料。首先，以1，8-萘內酰亞胺為給體，方酸為受體合成了NIR-I染料SQ2,引入丙二腈作為強吸電子基團使熒光發射紅移到NIR-II窗口，合成了SQ1。為了將NIR-II型熒光載體SQ1轉化為有效的治療藥物，構建了以纖維連接蛋白為靶點的SQ1納米探針，在血管造影和腫瘤成像(包括深部組織中的肺轉移灶)中顯示出優異的NIR-II成像性能。此外，SQ1納米探針可用于腫瘤的光聲成像和光熱消融。本研究表明，采用供體−受體工程策略開發近紅外-Ⅱ類方酸染料是可行和有效的。

方酸染料SQ1用于轉移性乳腺癌的NIR-II/PA雙峰成像和光熱消融的分子工程和納米功能化研究方案1.

首先，SQ1納米探針的構建與表征如圖1，具有受體工程的SQ1在930和970 nm處表現出明顯的紅移(圖1b，c)。因此，SQ1的熒光發射延伸到了近紅外-Ⅱ區，表明D−A−D工程成功地使SQ1成為近紅外-Ⅱ發射體。

圖1：(A)SQ1和SQ2有機合成示意圖，(B)四氫呋喃(THF)中SQ1和SQ2的吸光度和發射率，(d，e)密度泛函理論(DFT)計算(D)SQ1和(E)SQ2的HOMO和LUMO

為了將近紅外熒光團SQ1轉化為有效的熱敏劑，在超聲作用下，將溶解的SQ1與DSPE-PEG2000和DSPE-PEG2000-MAL一起在水中納米沉淀，制備SQ1@DSPE，在轉移性乳腺癌細胞中過表達的活性靶向纖維連接蛋白的多肽CREKA通過半胱氨酸(Cys)與SQ1@DSPE的反應被共價連接到SQ1@DSPE上就獲得SQ1納米探針。

圖2：SQ1納米探針的尺寸分析和光物理特性 (A)SQ1納米探針的DLS和TEM。(B)Sq1納米探針在PbS中的吸收光譜和熒光光譜，(c，d)近紅外-II型熒光圖像和(E)偽彩色圖像和(F)SQ1納米探針和SQ2納米探針，在915 nm光照下的定量曲線，(g，h)含有SQ1、SQ2納米探針(1 mg/mL)試管在近紅外激光(915 nm，100 mW/cm2)照射下，(G)在沒有和(H)覆蓋豬肉組織的情況下進行NIR-II成像

如圖2a所示，透射電子顯微鏡(TEM)和動態激光光散射(DLS)顯示SQ1納米探針的長度分別約為20 nm和42 nm。與SQ1相比，SQ1納米探針的吸收峰在930 nm處略有紅移至940 nm(圖2b)。與SQ1(0.13%)相比，與DSPE-PEG2000結合形成納米粒子后，SQ1納米探針的量子產率提高到1.7%。SQ1納米探針在940 nm處的強吸收也顯示了PA成像的潛力。SQ1納米探針在980 nm處顯示熒光峰延伸到NIR-II區域。SQ1型納米探針的熒光信號與納米探針濃度呈良好的線性相關(圖2c−f)。此外，在含有SQ1和SQ2納米探針(1 mg/mL)的試管上覆蓋豬肉切片，檢測組織滲透深度如圖2g，h所示，SQ1納米探針在915 nm(100 mW/cm2)的照射下，其明亮的NIR-II發射可以穿透覆蓋的豬肉切片(3 mm)。值得注意的是，DSPE-PEG2000的包裹和腫瘤靶向多肽的修飾幾乎沒有改變SQ1的光學性質，表明制備良好的SQ1納米探針適合于NIR-II成像。

圖3：(A)SQ1納米探針和SQ2納米探針的功率譜,(B)SQ1納米探針和SQ2納米探針在930 nm處的PA強度隨濃度的變化曲線,(C)SQ1納米探針和SQ2納米探針(0.0625、0.125、0.250.5、1.0mg/mL)在930nm處的PA圖像(D)SQ1、Q2納米探針(1 mg/mL)的光熱加熱圖像和(E)SQ1納米探針(0.125，0.25，0.5，1.0 mg/mL)在近紅外激光照射下的溫度曲線

接著，還研究了不同濃度的SQ1納米探針的PA強度和圖像。如圖3a所示，SQ1納米探針的PA光譜在930 nm處出現一個峰值，這與最大吸收相一致。根據圖3b，c中不同濃度的SQ1納米探針的PA圖像，PA信號與SQ1納米探針的濃度(0.0625−1 mg/mL)呈線性正相關。因此，將NIR-II成像與PA成像相結合作為雙峰成像可以提高乳腺癌的成像準確性。受近紅外區高吸收強度的啟發，進一步研究了SQ1納米探針的光熱性質。如圖3D所示，含有SQ1納米探針的試管溫度從29.3°C上升到70.5°C，而單獨含有PbS的試管在激光照射下溫度變化不大，SQ2納米探針的溫度略有升高，Q1納米探針的光熱轉換效率為25.6%。此外，圖3E中的SQ1納米探針在915 nm激光(0.5W/cm2)照射下表現出濃度依賴性的溫度變化，這表明SQ1納米探針可以用于腫瘤的光熱消融。

圖4：(a，b)乳腺癌細胞蛋白免疫印跡，(C)冰凍切片檢測細胞核(Dapi)和纖維連接蛋白(Alexa Fluor488標記的抗纖維連接蛋白抗體)(比例尺，50μm)，(D)SQ1納米探針SQ1NP+L處理的乳腺癌細胞存活率(e，f)用0.5 mg/mLSQ1納米探針(E)在黑暗中或(F)用0.5W/cm2的915 nm激光照射5min，對細胞進行鈣調素-AM/碘化丙啶(PI)染色，比例尺：100μm

接下來，為了研究纖連蛋白水平與乳腺癌腫瘤惡性程度之間的依賴性，通過高度惡性MDA-MB-231和低度惡性MCF-7細胞的western印跡測試纖連蛋白。如圖4a，b所示，纖維連接蛋白的表達與乳腺癌的惡性程度呈正相關。因此，通過纖維連接蛋白結合肽的修飾，SQ1納米探針可以用來靶向纖維連接蛋白，并根據乳腺癌腫瘤中纖維連接蛋白水平的差異來識別高危乳腺癌。

為了生物相容性的考慮，用CCK8檢測與SQ1納米探針孵育的MDA-MB231細胞的存活率。SQ1納米探針顯示出較低的細胞毒性，在與SQ1納米探針(0−512μg/mL)孵育24小時后，80%以上的細胞仍然存活(圖4d)。因此，SQ1納米探針是一種生物相容性顯像劑。最終，超過80%的MDA-MB-231細胞被SQ1納米探針介導的光熱效應殺死。SQ1納米探針(0.5 mg/mL)和近紅外激光(0.5W/cm2)預處理的MDA-MB-231細胞幾乎全部顯示SQ1納米探針能有效地在體外光熱殺滅腫瘤細胞。

圖5：SQ1納米探針的體內成像特性，(A)靜脈注射SQ1納米探針10分鐘后，對小鼠血管進行近紅外成像(NIR-II)，(b，c)兩個區(ROI 1和ROI 2)放大的后肢NIR-II圖像，(d，e)ROI1和ROI2后肢紅線的熒光強度，(F)靜脈注射SQ1納米探針或SQ1@DSPE(對照)后0、1、2、6、12和24小時，對陽性的MDA-MB-231腫瘤進行NIR-II顯像，(G)在NIR-II顯像后同時進行腫瘤PA顯像，比例尺是2mm

緊接著，為了顯示近紅外-II成像在血管造影中的優點，靜脈注射SQ1100−納米探針(100μL，100μg)后，用近紅外-II成像技術在1000mm1100 nm區域對小鼠血管進行成像。NIR-II成像可以清楚地顯示第二個窗口中由于組織穿透增加而導致的皮膚下血管的分布(圖5a)。高倍率的NIR-II圖像可以清楚地顯示通過小鼠后肢動脈的血液流動(圖5b，c)。提示NIR-II成像適用于血管造影(圖5d，e)。這些結果表明，使用SQ1納米探針進行血管造影的NIR-II成像是可行的。

然后為了研究SQ1納米探針在小鼠體內的近紅外成像能力，分別對SQ1納米探針(100μL，100μg)和非靶向SQ1@DSPE(100μL，100μg)進行了研究。如圖5f所示，對于注射SQ1納米探針的小鼠，腫瘤內的NIR-II成像信號顯著增強，注射SQ1@DSPE的小鼠腫瘤區域的熒光增強要弱得多。

如NIR-II和PA成像所示，SQ1納米探針可以很好地累積到MDA-MB-231腫瘤中，這主要是由于SQ1納米探針的有效主動靶向，而SQ1@DSPE通過被動靶向攝入腫瘤。這些結果表明SQ1納米探針具有顯著的腫瘤靶向成像能力。NIR-II/PA雙峰成像顯示靶向肽修飾的SQ1納米探針可以特異性結合纖連蛋白陽性乳腺癌腫瘤。這清楚地表明SQ1納米探針可以準確地檢測和表達纖維連接蛋白陽性乳腺癌的腫瘤病變。

圖6：使用SQ1納米探針對乳腺癌肺轉移小鼠的NIR-II成像，(a，b)靜脈注射SQ1納米探針后12h，(A)荷肺轉移瘤小鼠和(B)正常小鼠的NIR-II顯像，(C)肺轉移小鼠和(D)正常小鼠全身NIR-II成像后的器官的體外NIR-II成像，(E)肺轉移小鼠和(F)正常小鼠肺切片經NIR-II成像后進行(e，f)H&E組織化學分析，比例尺為200μm

為了進一步評估SQ1納米探針定位乳腺癌轉移性肺部病變的能力。與正常小鼠相比，攜帶肺轉移的小鼠的肺顯示增強的NIR-II熒光信號，表明SQ1納米探針可以選擇性地靶向乳腺癌的肺轉移病灶（圖6a，b）且發現患有轉移性乳腺癌的小鼠的肺確實顯示出增加的信號，表明SQ1納米探針在肺轉移模型中的腫瘤特異性靶向能力（圖6c，d）。如圖6e，f所示，攜帶轉移性腫瘤的小鼠肺中的多個病變顯示肺切片中存在浸潤性腫瘤細胞，這進一步證實SQ1納米探針能夠通過深度穿透來解決乳腺癌的肺轉移。

圖7：使用SQ1納米探針(SQ1NP)對小鼠乳腺癌腫瘤進行熱成像和PTT，(A)注射PBS或SQ1NP加激光治療后腫瘤的熱成像。(B)光熱治療過程中腫瘤的溫度變化，(C)腫瘤生長曲線；(D)治療期間小鼠生長曲線，(E)PBS、PBS+L、SQ1NP、SQ1NP+L治療后解剖腫瘤重量，標尺為50μm。

最后，SQ1納米探針具有良好的腫瘤靶向性和良好的體外治療效果，進一步促進了對乳腺癌光熱治療的體內評價。如圖7a，b所示，注射SQ1納米探針的小鼠的腫瘤溫度從33.2°C迅速上升到59.1°C，而PBS預處理的腫瘤溫度沒有明顯變化。這些結果證實了SQ1納米探針在近紅外輻射下確實能誘導腫瘤發生顯著的熱變化。為驗證其光熱治療效果，對MDAMB-231乳腺癌荷瘤小鼠分別治療，如圖7c所示，隨著時間的推移，腫瘤體積的這些差異變得更加明顯。此外，小鼠的體重變化與H&E組織化學分析顯示SQ1納米探針在近紅外激光照射下對乳腺癌腫瘤有明顯的光熱損傷作用，具有較高的光熱治療效率。

結論：通過合理的D-A-D工程，合成了一種發射延伸至第二窗口的方堿染料。方酸染料SQ1通過簡單的納米沉淀和靶向多肽修飾可以被包裹成SQ1納米探針，顯示出NIR-II/PA雙峰成像能力和良好的光熱效應。小鼠的NIR-II顯像表明，SQ1納米探針適合于血管造影和腫瘤靶向顯像，尤其是肺轉移灶。此外，SQ1納米探針利用在近紅外輻射下優異的光熱轉換能力，在實體腫瘤的PA成像和PTT中都表現良好。考慮到它在NIR-II區域的治療學的固有優勢，基于方酸的治療納米探針將啟發其他轉移性乳腺癌的創新設計。

參考文獻

Yao D, Wang Y, Zou R, Bian K, Liu P, Shen S, Yang W, Zhang B, Wang D. Molecular Engineered Squaraine Nanoprobe for NIR-II/Photoacoustic Imaging and Photothermal Therapy of Metastatic Breast Cancer. ACS Appl Mater Interfaces. 2020 Jan 29;12(4):4276-4284. doi: 10.1021/acsami.9b20147. Epub 2020 Jan 14. PMID: 31896256.

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