細(xì)胞培養(yǎng)是生命科學(xué)研究中相對(duì)基礎(chǔ)的實(shí)驗(yàn)，做好細(xì)胞培養(yǎng)是實(shí)驗(yàn)邁向成功的第一步。在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，保持無(wú)菌操作流程，維持無(wú)菌的工作區(qū)域，選擇合適的培養(yǎng)基以及提供適宜的培養(yǎng)環(huán)境有助于細(xì)胞增殖。同時(shí)，監(jiān)測(cè)新培養(yǎng)的細(xì)胞狀態(tài)也是必不可少的環(huán)節(jié)。

Step 1
工作區(qū)域準(zhǔn)備

1.準(zhǔn)備無(wú)菌工作區(qū)域并對(duì)設(shè)備消毒
用70%的酒精噴霧噴灑在超凈工作臺(tái)表面和內(nèi)部，也可用其余常見(jiàn)消毒劑如鹽溶液。

• 保持超凈工作臺(tái)表面潔凈：請(qǐng)勿在細(xì)胞培養(yǎng)的地方存放物品并移除與細(xì)胞培養(yǎng)無(wú)關(guān)的物品，以保持潔凈氣流的流動(dòng)。
• 提前用30~50min紫外線滅菌燈處理工作區(qū)內(nèi)積累的微生物。在關(guān)閉紫外燈后應(yīng)啟動(dòng)送風(fēng)機(jī)，運(yùn)轉(zhuǎn)其兩分鐘后再進(jìn)行培養(yǎng)操作。
• 保證超凈工作臺(tái)通風(fēng)。如果長(zhǎng)時(shí)間不使用可將通風(fēng)關(guān)閉。

2.穿戴實(shí)驗(yàn)服并洗凈雙手
使用抗菌肥皂和溫水洗手，進(jìn)入無(wú)菌房時(shí)需穿戴無(wú)菌服、帽子和口罩等其他實(shí)驗(yàn)要求的個(gè)人防護(hù)裝備。

3.消毒實(shí)驗(yàn)所需的試劑、溶液以及其他培養(yǎng)基
使用高壓滅菌器或無(wú)菌過(guò)濾器時(shí)，需參照具體的操作滅菌流程。例如在使用高壓滅菌器時(shí)，應(yīng)對(duì)消毒的物品進(jìn)行預(yù)處理，排掉高壓滅菌器中的空氣，算好滅菌時(shí)間以保證達(dá)到理想的滅菌效果。同時(shí)在使用此方法進(jìn)行滅菌時(shí)也應(yīng)注意滅菌的容器蓋需松開(kāi)，試劑瓶中需滅菌的溶液不可裝得過(guò)滿等。

4.按照無(wú)菌操作程序工作以避免污染
化學(xué)或生物污染細(xì)胞培養(yǎng)基可能會(huì)導(dǎo)致整個(gè)實(shí)驗(yàn)的失敗，為了防止這些污染物進(jìn)入細(xì)胞培養(yǎng)基，應(yīng)始終遵循無(wú)菌操作。

化學(xué)污染物包括洗滌劑、水、內(nèi)毒素和細(xì)胞培養(yǎng)基中的污染物。生物污染物包括霉菌、酵母、細(xì)菌、病毒和支原體。
 

Step 2
細(xì)胞、培養(yǎng)物和培養(yǎng)基的選擇

1.選擇符合實(shí)驗(yàn)要求的細(xì)胞系

實(shí)驗(yàn)操作者可以從不同的渠道獲得動(dòng)物細(xì)胞系（通過(guò)原代細(xì)胞建立培養(yǎng)細(xì)胞系，或者從細(xì)胞庫(kù)直接購(gòu)買(mǎi)已經(jīng)建立的細(xì)胞系）。選擇符合實(shí)驗(yàn)要求以及高質(zhì)量的細(xì)胞系，以增加成功實(shí)驗(yàn)的機(jī)會(huì)。在選擇細(xì)胞系時(shí)有一些標(biāo)準(zhǔn)需要考慮其中包括：細(xì)胞的種類、細(xì)胞的功能特性、細(xì)胞的生長(zhǎng)條件和特性。

2.貼壁細(xì)胞培養(yǎng)

貼壁細(xì)胞在培養(yǎng)時(shí)必須有可以貼附的支撐物表面（如培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿的底面）。培養(yǎng)的細(xì)胞依靠自身分泌的細(xì)胞外基質(zhì)與其表面表達(dá)的或培養(yǎng)基中的黏附因子相結(jié)合進(jìn)行增殖。因?yàn)榧?xì)胞是否貼壁與細(xì)胞本身分泌細(xì)胞外基質(zhì)的能力和其本身表達(dá)黏附因子的數(shù)量相關(guān)，因此需要提前檢查所使用的細(xì)胞系的規(guī)格，以確定是否需要這種類型的培養(yǎng)。

3.懸浮細(xì)胞培養(yǎng)

懸浮細(xì)胞的生長(zhǎng)不依附于支撐物表面。相反，它們是在液體中自由漂浮的，這可以更容易地通過(guò)添加培養(yǎng)基來(lái)擴(kuò)大培養(yǎng)。有些細(xì)胞系已經(jīng)明確采用懸浮培養(yǎng)，所以培養(yǎng)該類細(xì)胞時(shí)，需提前確認(rèn)培養(yǎng)方式。

4.選擇合適的培養(yǎng)基

培養(yǎng)基是培養(yǎng)環(huán)境中最重要的組成部分，因?yàn)樗鼮榧?xì)胞生長(zhǎng)提供了必要的營(yíng)養(yǎng)、生長(zhǎng)因子和激素，并調(diào)節(jié)培養(yǎng)物的pH值和滲透壓。理想的培養(yǎng)基取決于你所使用的細(xì)胞類型，一些常見(jiàn)的類型包括：基礎(chǔ)培養(yǎng)基、減血清培養(yǎng)基和無(wú)血清培養(yǎng)基。
 

Step 3
細(xì)胞監(jiān)測(cè)

1.檢查細(xì)胞培養(yǎng)基的pH值和CO₂水平
對(duì)于大多數(shù)細(xì)胞系，培養(yǎng)基的CO₂濃度一般保持在5-10%之間。然而，培養(yǎng)基的理想pH值會(huì)根據(jù)不同的細(xì)胞類型而變化，所以一定要檢查細(xì)胞培養(yǎng)的pH值。例如，哺乳動(dòng)物細(xì)胞在pH值為7.4時(shí)生長(zhǎng)得最好，而昆蟲(chóng)細(xì)胞在pH值為6.2時(shí)生長(zhǎng)得最好。

2.調(diào)節(jié)溫度以達(dá)到最佳培養(yǎng)環(huán)境
有些細(xì)胞只能在較窄的溫度范圍內(nèi)生長(zhǎng)，而有些細(xì)胞則可以在較寬的溫度范圍內(nèi)生長(zhǎng)。考慮使用的培養(yǎng)箱類型，調(diào)整環(huán)境溫度，使培養(yǎng)箱維持在穩(wěn)定的參數(shù)。一些常見(jiàn)的溫度建議包括：

• 人類和哺乳動(dòng)物細(xì)胞：36-37°C
• 禽類細(xì)胞：38.5°C
• 冷血細(xì)胞：15-26°C