BONE RES 椎間盤單細胞轉錄組圖譜精準揭示人類椎間盤細胞亞型
本文作者：Christine Zheng
陸軍軍醫大學陸軍特色醫學中心
隨著社會老齡化程度不斷升高，導致椎間盤退行性疾病的發病率日漸上升，并呈年輕化趨勢。椎間盤退行性疾病（DDD）是導致腰腿部位疼痛的主要原因，不僅影響患者的生活質量，而且對社會的醫療和經濟資源帶來了沉重的負擔。
目前對于DDD的治療，主要依靠臥床、康復治療、藥物、介入及手術治療等手段，但這些手段只能減輕患者的癥狀，很難重建椎間盤（IVD）的穩態環境。因此，急需深入探索椎間盤生理與病理機制，對椎間盤退行性疾病的治療具有重大指導意義。由于椎間盤細胞的高度異質性以及復雜的細胞微環境，以往的研究通過bulk RNA測序解析椎間盤內分子事件已很難滿足深入研究的需要，導致椎間盤的生理與病理機制仍然遠未闡明。
近日，陸軍軍醫大學陸軍特色醫學中心（重慶大坪醫院）骨科 劉鵬課題組 與中國人民解放軍總醫院第五醫學中心 劉兵課題組 聯合，在陸軍醫大學陸軍特色醫學中心（重慶大坪醫院） 陳林課題組 的支持下，繪制了首個人類椎間盤細胞圖譜，在Bone Research發表了題為 Spatially defined single-cell transcriptional profiling characterizes diverse chondrocyte subtypes and nucleus pulposus progenitors in human intervertebral discs的封面研究論文。
研究人員采集了11個椎間盤，并且對髓核、纖維環、軟骨終板組織進行分離，分別從以上組織中分離提取細胞，對細胞進行單細胞轉錄組測序。
在經過質控和多連體排除后，作者對108108個單細胞進行了測序，通過對2651個差異表達基因（DEGs）進行分析，并對測序數據進行tSNE可視化處理，最終得到了9個亞群。
這些亞群包括3個SOX9+ 軟骨細胞亞群、脊索細胞、基質細胞、周細胞、內皮細胞、髓核祖細胞以及血細胞。
隨后，作者對樣本進行了免疫組化染色，驗證了幾個主要細胞亞群在椎間盤中的空間定位(圖1)。
此外，為了驗證這種椎間盤細胞的異質性在物種間具有高度的保守性，作者比較了人類與大鼠間椎間盤細胞的單細胞轉錄組測序數據，發現多數在人類椎間盤的細胞亞群在大鼠椎間盤中同樣存在，包括髓核祖細胞，內皮細胞，以及周細胞。
圖1：健康人椎間盤中AF（纖維環）NP（髓核）CEP（軟骨終板）的免疫組化染色
作者通過進一步的研究，根據功能的差異，將椎間盤軟骨細胞分為三類：
1、調控型軟骨細胞通過活躍的生長因子表達和成軟骨信號通路調控，在軟骨ECM穩態中發揮重要作用。
2、高度分化的穩態軟骨細胞處于靜息狀態，主要負責ECM的沉積。3、效應型軟骨細胞處于高代謝活性狀態，與維持椎間盤中ECM的合成密不可分，并且具有PRG4高表達的特性，能夠降低剪切壓力與感染的損傷，對關節具有保護作用。
此外，作者團隊通過免疫染色發現，在髓核區域內存在一群PDGFRA+PROCR+的軟骨祖細胞亞群，這群細胞具有潛在的干性，并且特異性表達PRRX1（圖2）。
圖2：免疫熒光染色顯示PDGFRA/PROCR/PRRX1在人類椎間盤細胞內的共表達情況
隨后，作者通過流式細胞分選，將不同的細胞亞群進行了純化富集。
通過體外實驗，研究人員發現與PROCR-細胞亞群相比，PROCR+亞群具有很強的體外克隆形成能力。免疫熒光染色結果提示，在PROCR+細胞亞群中，軟骨生成相關轉錄因子p-SMAD3高度活化（圖3）。最后的體外分化實驗證實，PROCR+祖細胞具有成骨、成軟骨以及成脂的三系分化能力（圖4）。
圖3：免疫熒光染色揭示PROCR+ 與PROCR- 亞群中p-SMAD3的表達差異
圖4：PROCR+亞群經過成骨、成脂、成軟骨誘導后的茜素紅、油紅O、阿爾新藍、蕃紅O-固綠染色
綜上，該研究通過單細胞表達譜測序，首次繪制了人類的椎間盤單細胞圖譜，在單細胞水平上定義了軟骨細胞亞群，讓我們對椎間盤細胞的異質性有了全新認識；并且作者在空間上對這些不同的亞群進行了解析和定位，通過基因分析揭示了它們的調控特征。
此外，作者團隊在髓核中鑒定得到一群具有干性潛能的祖細胞，為人類椎間盤退行性疾病的治療提供了新的理論基礎。
文中組織切片的圖像主要利用奧林巴斯VS200研究級全玻片掃描系統獲得，該系統支持明場與熒光等五種常見的觀察方法，通過配置的X Line高性能物鏡，可以為用戶提供平場性更好的圖像；自動聚焦和自動樣品檢測功能可以使系統的拍攝效率大大提高，同時不失精準；TruAI深度學習技術的強大功能，可以準確識別出樣品的形態特征，并且可以準確分割目標區域，在簡單易學的前提下幫助用戶節約分析圖像的時間。
此外，細胞的免疫熒光染色圖像主要通過奧林巴斯全新一代超高分辨轉盤共聚焦系統SpinSR10獲得，該系統具有奧林巴斯特有的超高分辨模塊，無需特殊熒光標記染料，XY分辨率可達到110nm，輕松解析精細結構；基于轉盤的共聚焦掃描單元可以實現高幀率的圖像采集，不錯過每一個瞬間；該系統極低的光毒性對標本的破壞很小，尤其適用于活細胞的觀察。
陸軍軍醫大學陸軍特色醫學中心（大坪醫院）骨科 劉鵬教授 與 解放軍總醫院第五醫學中心 劉兵研究員 為該論文的共同通訊作者，甘翼搏 博士后與 賀健 博士為論文的共同第一作者，陸軍特色醫學中心為第一完成單位。該工作也得到了陸軍特色醫學中心陳林教授課題組的參與和支持。
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