近年來(lái)，三維 (3D) 培養(yǎng)模型作為一種有效的生物研究工具越來(lái)越受到認(rèn)可。與傳統(tǒng)的單層培養(yǎng)系統(tǒng)相比，3D 培養(yǎng)的細(xì)胞更接近于模擬生物體的生理環(huán)境。一種廣泛使用的 3D 培養(yǎng)技術(shù)是多細(xì)胞球體的應(yīng)用。球狀體是無(wú)異物生長(zhǎng)的微型球形細(xì)胞團(tuán)。
 

2. 方案介紹

有多種方法可用于生成球體。所有可用的方法都可以防止細(xì)胞附著在培養(yǎng)皿基質(zhì)上，從而增加與鄰近細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用。在本應(yīng)用說(shuō)明中，我們使用液體疊加技術(shù)來(lái)生成球體。這種方法是形成球體的最簡(jiǎn)單的方法之一，并有幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)。首先，可以生成和監(jiān)測(cè)單個(gè)球體，從而可以輕松評(píng)估生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)和球體特性。其次，簡(jiǎn)單的培養(yǎng)基交換允許更長(zhǎng)的培養(yǎng)時(shí)間。最后，不需要特殊設(shè)備。簡(jiǎn)而言之，在加入細(xì)胞懸液之前，孔用瓊脂糖包被。除了提供非粘性表面，瓊脂糖包被的孔還增加了細(xì)胞與細(xì)胞之間的接觸，因?yàn)榧?xì)胞聚集在它們的凹底上。
 

本方案用以下實(shí)驗(yàn)材料：

· µ-Plate 血管生成 96 孔 ibiTreat (ibidi, 89646)

· 1% 瓊脂糖（溶于 PBS）（例如 Sigma-Aldrich Chemie GmbH，A9539）

· 胰蛋白酶或細(xì)胞分離的替代品

· 細(xì)胞培養(yǎng)基

 以下需要設(shè)備：

· 用于融化瓊脂糖的熱培養(yǎng)箱、微波或高壓釜

· 用于測(cè)定生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)的倒置顯微鏡

· 細(xì)胞培養(yǎng)箱（通常為 37°C、5% CO2 和 95% 相對(duì)濕度）
 

材料的制備：

1. 在 PBS 中制備 1% 瓊脂糖。

2. 用 30 µl 瓊脂糖涂抹孔。瓊脂糖形成凝膠并在 10 分鐘內(nèi)冷卻至室溫。該體積適合完全覆蓋孔的表面并產(chǎn)生凹面。

注意：瓊脂糖應(yīng)放置在溫水浴中，以防止移液過(guò)程中過(guò)早凝膠化。此外，吸頭和板應(yīng)在制備前一小時(shí)置于 50°C。
 

球體形成：

1. 像往常一樣準(zhǔn)備細(xì)胞懸液。

2. 制定細(xì)胞數(shù)并將細(xì)胞懸浮液稀釋到所需的細(xì)胞濃度（考慮圖 1 作為參考）。

3. 將 55 µl 細(xì)胞懸浮液加入到每個(gè)孔中。

4. 在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育板。

5. 在兩天的初始孵育時(shí)間后，應(yīng)每隔一天輕輕更換培養(yǎng)基。盡量減少板的移動(dòng)，特別是在球體啟動(dòng)期間。

6. 球體的形成和生長(zhǎng)可以使用相差顯微鏡和球體活力進(jìn)行評(píng)估，使用熒光素二乙酸酯 (FDA)/碘化丙啶 (PI) 染色，使用 FDA 和 PI 進(jìn)行活/死染色”。
 

· 可以通過(guò)調(diào)整播種濃度或孵化時(shí)間來(lái)控制球體的大小和特性（圖 1）。

· 球體形成、生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)和球體特征取決于細(xì)胞類型（圖 2、3）。

· 血清的類型和質(zhì)量嚴(yán)重影響球體的形成和生長(zhǎng)。

· 不規(guī)則或不充分的瓊脂糖涂層會(huì)導(dǎo)致形成幾個(gè)不規(guī)則的球體和/或每孔細(xì)胞粘附。不要讓瓊脂糖冷卻到 50°C 以下，以盡量減少分配過(guò)程中凝膠化的風(fēng)險(xiǎn)。

· 不規(guī)則和非圓形球體的形成可歸因于培養(yǎng)基和/或血清中的小顆粒。如果需要，通過(guò)顯微鏡監(jiān)測(cè)培養(yǎng)基和培養(yǎng)基補(bǔ)充劑，并通過(guò)無(wú)菌過(guò)濾器過(guò)濾補(bǔ)充培養(yǎng)基。
 

圖 2. HT-1080 和 HeLa 細(xì)胞系的球體形成和生長(zhǎng)，在 µ-Plate Angiogenesis 96 孔中以不同的初始細(xì)胞濃度接種。 （比例尺：800 µm）

圖3.MCF-7 球體的球體生長(zhǎng)取決于播種濃度和培養(yǎng)時(shí)間

圖4.MCF-7 球體大小與壞死中心大小之間的相關(guān)性

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