病毒載體包裝過程是復雜的，在做病毒包裝實驗中，科研工作者常遇到一些問題。為了讓大家在病毒包裝這塊少走彎路，《細胞基因編輯小課堂欄目》特邀賽業生物細胞生物學產品經理針對病毒包裝常見的問題為大家進行經驗總結與心得分享。繼慢病毒包裝之后，我們的腺相關病毒（Adeno-associated virus, AAV）包裝常見問題解答也推出了上下兩篇。今天我們接著進行AAV包裝常見的問題解答：

Q1：AAV的注射方式，有尾靜脈注射也有局部原位注射，該怎么選？
AAV的體內注射（給藥）方式分為系統性給藥和局部給藥，系統性給藥主要有尾靜脈、頸靜脈、眼眶靜脈和腹腔靜脈給藥；

局部給藥方式常見的包括腦立體定位、肌肉定點注射、心肌原位注射、玻璃體腔內注射、關節腔注射等；

系統性給藥是特點是病毒注射的體積較大，一般需要100~1000μl不等，病毒在體內擴散的范圍廣，一般系統性給藥的方式操作較為簡單，給藥比較方便；

局部給藥則病毒注射量要求較少，一般100μl以內，但對滴度要求較高；由于是直接將AAV遞送到目標組織，局部給藥會有更好的靶向性，如果是臨床基因治療，局部給藥注射的病毒量少，因此病理毒性會更小。

Q2：AAV注射小鼠，多少病毒量才夠呢？
影響AAV注射總量的因素很多，比較重要的有血清型、目標組織類型、注射方式（局部or全身）、動物模型（如大鼠or小鼠）等，對于有文獻報道的，可參考文獻的注射方法，最好設置幾個不同的梯度。例如AAV9感染小鼠心臟組織（心肌細胞），可采用尾靜脈注射也可采用心肌多點注射的方式，尾靜脈注射推薦1011 vg/mL，100μL；原點注射則推薦1010 vg/mL，20 μL/點。

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Q3：AAV注射后多久起效？有辦法縮短其表達時間嗎？
在我們的上期有提到，AAV進入細胞后需經歷一個從單鏈DNA變成雙鏈DNA的過程，因此，目的基因開始表達所需的時間較長，一般在1周左右或以上可以檢測到，這個也跟目的基因相關，不同基因的表達高峰時間是不同的。

另外，可采用自互補AAV（Self-complementary Recombinant Adeno-Associated Virus ，scAAV）加快表達速度，scAAV是通過改造其中的一個ITR使得AAV可形成二聚體，其進入細胞可直接進行表達，在多種組織中表達更迅速且表達水平更高。但缺點是，scAAV的包裝容量進一步縮小，約為AAV的一半，因此只能用于基因片段較小的研究。

Q4：AAV體內注射純化的目的是什么？
如果是用于體外感染細胞的病毒，一般不用純化，但對于用于注射至體內的病毒，無論是慢病毒還是AAV，均有必要進行純化。這是由于病毒在包裝生產過程中，未經純化的病毒液含有大量的病毒外殼、細胞（293T）內毒素、破損顆粒、及細胞碎片等，這些物質如果隨病毒一起注射到動物體內，可能會引發強烈的免疫反應，從而影響動物的生存狀態。另外病毒純化也是一個濃縮的過程，有利于后續的稀釋使用。

Q5：為什么AAV是目前基因治療領域最熱門的載體？
這是因為AAV具備以下優勢：

1、宿主范圍廣：分裂和非分裂細胞；

2、安全性高：未發現致病AAV；ITR和rep/cap獨立質粒表達；

3、免疫原性低：對動物或人體造成的免疫反應小，幾種病毒載體中相對最小；

4、靶向性好：多種血清型，組織特異性。

但目前AAV并不是完美的，仍有許多需要優化和改進的地方，如特異性還有待提高，從而減少AAV的使用劑量，降低毒理風險；通過載體改造提升載體容量，解決較大片段基因治療的問題；另外還需要開發更多具備不同功能的AAV，如跨血腦屏障、跨突觸等。

本文來自賽業生物(www.cyagen.com)