內皮功能障礙作為一種病理狀態，被認為是動脈粥樣硬化進展中的一個關鍵事件。動脈壁中的脂質積累是動脈粥樣硬化的明確特征之一，血管內壁的內皮細胞功能障礙是動脈粥樣硬化斑塊形成的早期事件。

自噬是一種保守的細胞過程，可降解和回收受損的細胞內聚集體和細胞器。自噬過程伴隨巨噬細胞的增加。在人類中，自噬通過極化線粒體和阻止細胞色素c的釋放，也為動脈粥樣硬化斑塊的細胞提供了一種保護，以對抗細胞氧化應激。動脈粥樣硬化進展的特征是自噬受損。據報道，在動脈粥樣硬化期間，各種機制涉及自噬受損或自噬相關的分子變化。

眾所周知的自噬受體 p62/SQSTM1 (p62) 在細胞的選擇性自噬和細胞抗氧化反應中發揮重要作用。由于p62將包括脂質在內的細胞內自噬物質運輸到自噬體進行降解，自噬的破壞會導致 p62 積累。p62水平升高通常被認為是自噬活性受到抑制的標志。

有兩種主要的細胞內降解系統：泛素-蛋白酶體系統（UPS）和自噬-溶酶體系統。這些系統在檢測和去除錯誤折疊蛋白方面發揮著重要的監視作用。由于 p62 作為一個橋梁，蛋白酶體抑制可以激活自噬。由于泛素化是可逆的，它在自噬中具有雙向作用，泛素化也及時參與調節自噬。

盡管有報道稱在受損細胞條件下p62水平升高表明自噬缺陷，但人們認為p62的積累可能是一種適應不良或細胞保護反應，尤其是在動脈粥樣硬化中。基于此，來自韓國尚志大學醫學院、延世大學醫學院神經科系、京畿大學生命科學系等的專家學者進行了深入研究，旨在闡明在動脈粥樣硬化條件下 p62 介導的自噬在人內皮細胞 (ECs ) 中的作用。相關研究成果發表在 International Journal Molecular Sciences 題為《P62 Links the Autophagy Pathway and the Ubiquitin–Proteasome System in Endothelial Cells during Atherosclerosis》。

實驗結果：

oxLDL 在共培養的 HUVEC 和 THP-1 細胞中誘導先天免疫反應和炎癥

為了模擬動脈粥樣硬化條件下的血管狀況，共培養人臍靜脈內皮細胞 (HUVEC) 和人單核細胞 THP-1 細胞，并用氧化低密度脂蛋白 (oxLDL、50 µg/mL) 處理 6、12、24 或 48 小時。然后從共培養物中收集上清液并使用 ELISA 測量 C1q 的水平，C1q 是一種先天免疫分子，是補體系統的經典途徑的一部分。

在oxLDL處理后24小時，C1q仍在增加，但沒有進一步增加 (圖1 A)。接下來，從共培養物中分離出的細胞裂解液在蛋白質水平上進行分析。值得注意的是，HUVECs 中的 C1q 蛋白水平與分泌的 C1q 水平相似 (圖1 B)。

此外，還分析了 oxLDL作用下THP-1細胞中被裂解的IL-1β蛋白水平，發現oxLDL處理后24小時，IL-1β被裂解最高，48小時時略有下降 (圖1 C)。采用BODIPY對HUVECs和THP-1細胞進行染色，研究oxLDL處理后各細胞的脂質沉積情況。在共培養的 HUVECs 和 THP-1 細胞中，在 0、6 和 24 小時檢測到 oxLDL 處理后的脂質負荷，脂質積累在 24 小時而不是在 6 小時時顯著增加 (圖1 D)。
 

圖 1  oxLDL 在共培養的巨噬細胞和內皮細胞上的暴露

自噬被誘導但在動脈粥樣硬化條件下發生功能障礙

首先，檢測共培養中HUVECs 和 THP-1 細胞的自噬水平。自噬陽性 HUVECs 的數量在 oxLDL 暴露后 8 h 顯著增加，在 24 h 達到峰值，然后在 48 h 下降 (圖2 A)。在THP-1細胞中，自噬陽性細胞的數量在8 h時增加，但在48 h后仍保持在較高水平 (圖2 B)。

然而，這項研究主要集中在暴露于oxLDL的動脈粥樣硬化條件下受損的HUVECs。如圖1 D所示，確定脂質被加載到HUVECs中，從而研究了自噬在清除 HUVECs 中沉積的脂質中的作用。通過蛋白質印跡分析了 HUVECs 中自噬相關蛋白Beclin1 、p62、LC3-II 的水平 (圖2 D)。

結果表明，與 THP-1 細胞相比，beclin-1 和 p62 蛋白水平均呈時間依賴性增加，但略有延遲。此外，在 oxLDL 暴露 24 小時后，LC3-II 的水平增加，但在 48 小時后下降。此外，溶酶體關聯膜蛋白2 (LAMP2) 蛋白水平逆轉為 p62 蛋白水平。出乎意料的是，在暴露于 oxLDL 后，LAMP2 的水平以時間依賴性方式降低。
 

圖 2  oxLDL暴露時共培養巨噬細胞和內皮細胞的自噬啟動

下調 p62 誘導替代降解系統

為了更好地了解自噬和自噬受損在動脈粥樣硬化條件下的作用，在 oxLDL 暴露前，p62被siRNA沉默48小時。因此，當與 oxLDL 共培養 24 小時時，siRNA處理的HUVECs中p62 mRNA 和蛋白水平均下調。長期暴露于oxLDL可損害內皮細胞的自噬。

THP-1與HUVECs共培養時，沉默p62, HUVECs中的LC3-II降低，負載的脂質相應增加。同樣，代表自噬執行的 LC3 陽性水平受到 p62 下調和蛋白酶體系統抑制劑的阻礙。與 LC3 相反，oxLDL暴露降低了LAMP2 mRNA水平，p62的下調沒有顯著改變LAMP2 mRNA水平。然而，LAMP2 的蛋白質水平因 p62 下調而升高。此外，siRNA-p62 處理的 HUVECs 中 LAMP2 陽性信號略有增強，足以克服 oxLDL 損傷。

E3 連接酶參與動脈粥樣硬化條件下的自噬

通過qPCR在mRNA水平檢測E3連接酶的變化。Cul4 是 CRL E3 連接酶家族的成員，在oxLDL暴露于HUVECs后24 h表達增加，48 h表達減少 (圖3 B)。此外，在 p62 沉默的 HUVECs 中 mRNA 水平降低。另一種 E3 連接酶 NEDD4 是 HECT E3 連接酶的一個組成部分，其 mRNA 水平在oxLDL處理或p62敲低時沒有變化 (圖3 C)。

為了進一步闡明自噬和蛋白酶體泛素系統在清除致動脈粥樣硬化物質中的作用，將 p62-siRNA、MG132（蛋白酶體抑制劑）、heclin（HECT E3 連接酶抑制劑）和 MLN4924（CRL E3 連接酶抑制劑）注入暴露于oxLDL的細胞中 (圖3 D)。通過沉默 p62，與 si 對照處理的 HUVECs 相比，多聚泛素化蛋白FK2 檢測到的多泛素化蛋白是豐富的。相反，用 MG132 和 MLN4924 處理減少了多泛素化蛋白，但用 HECT E3 連接酶抑制劑 Heclin 處理沒有改變 (圖3 D)。
 

圖 3  E3 連接酶參與自噬

實驗結論：

總的來說，這項研究探索了p62介導的人內皮細胞與巨噬細胞共培養條件下的自噬。暴露于 oxLDL 后，脂質在 ECs 中積累并誘導自噬，但在長期暴露于 oxLDL 后未能降解。細胞內脂質過多會導致溶酶體功能障礙，蛋白酶體系統可以幫助緩解這一問題。

這項研究證明了在動脈粥樣硬化條件下溶酶體和蛋白酶體降解之間的相互作用，而未來也需要進一步研究 E3 連接酶抑制劑的靶點、每種 E3 連接酶的作用以及特定的 E3 連接酶與自噬相關分子之間的相互調節機制。

參考文獻：Kim S, Lee W, Cho K. P62 Links the Autophagy Pathway and the Ubiquitin-Proteasome System in Endothelial Cells during Atherosclerosis. Int J Mol Sci. 2021 Jul 21;22(15):7791. doi: 10.3390/ijms22157791. PMID: 34360560; PMCID: PMC8346161.

小編旨在分享、學習、交流生物科學等領域的研究進展。如有侵權或引文不當請聯系小編修正。微信搜索公眾號“Naturethink”，學習更多關于流體機械力學刺激細胞培養相關知識吧！