基因治療是通過將修飾的基因傳遞至靶細胞中，從而把患者體內的突變基因替換為相對應的健康基因拷貝來實現治療或者預防疾病的目的。與傳統的藥物治療相比，基因治療是從根本上對疾病進行控制，所以有著非常好的發展前景，在世界范圍內得到越來越多醫藥行業的關注和投入。

將正常基因（外源）導入生物細胞內必須借助一定的技術方法或載體，基因轉移的方法分為生物學方法、物理方法和化學方法。

病毒越來越多的用作載體，用于傳遞基因治療的遺傳物質和疫苗應用。重組腺相關病毒（recombinant Adeno-Associated Viruses, rAAV）是基因治療最為常用的病毒載體之一。

 

一、如何開發高效安全的 rAAV 療法?
 

為了開發通過受控和經濟的制造工藝生產的高效的 rAAV 療法，需要解決從病毒衣殼設計到確定最佳工藝和配方條件，再到全面質量控制的多重挑戰。應對這些挑戰，需要針對 rAAV 樣品下列屬性進行量身定制的分析表征：
 

Ø  測定衣殼蛋白或者顆粒滴度（capsidor particle titer）

Ø  完整 rAAV 顆粒的百分比

Ø  空-載比（Full-empty ratio）

Ø  顆粒的粒徑

Ø  聚集體形成（aggregate formation）

Ø  熱穩定性（Thermal stability）

Ø  基因組釋放（genome release）

Ø  衣殼電荷（capsid charge）等

而所有這些都可能影響最終產品的關鍵質量屬性（CQA）。

通常，rAAV 滴度和病毒載量是使用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）、定量聚合酶鏈式反應（qPCR）、液滴數字聚合酶鏈式反應（ddPCR）、分析超速離心（AUC）和電子顯微鏡（EM）的技術組合測定的。這些方法通常既費時又費力，而且其準確性和精確性也值得懷疑[1]。因此，業內越來越需求一種不依賴于使用專用試劑和昂貴的參考標準品的快速分析解決方案。

動態光散射(DLS)、多角度動態光散射（MADLS）、電泳光散射（ELS）、尺寸排阻色譜-多角度光散射（SEC-MALS）、納米顆粒跟蹤技術（NTA）、等溫滴定量熱法（ITC）和差式掃描量熱法（DSC）可以提供有關病毒載體的關鍵分析和質量屬性的重要信息，從而能夠對多種參數進行表征、比較和優化。
 

樣品關鍵參數	馬爾文帕納科的技術方案
衣殼蛋白尺寸	DLS、NTA
衣殼蛋白及轉基因 的絕對分子量	SEC-MALS (OMNISEC)
衣殼滴度或顆粒計數	MADLS, SEC-MALS (OMNISEC), NTA
含基因病毒顆粒百分比分析	SEC-MALS (OMNISEC)
聚集形成分析	DLS, MADLS, SEC-MALS (OMNISEC), NTA
碎片化分析	SEC-MALS (OMNISEC)
熱穩定性分析	DLS, DSC
高級結構分析	DSC
血清型鑒定	DSC
衣殼解聚及基因組注入	DLS, DSC
衣殼蛋白尺寸	ITC
電荷分析	ELS

表1 總結了病毒載體研究中各種重要的關鍵屬性（CQA），以及馬爾文帕納科可以對應提供表征此類信息的各項技術。

DLS、MADLS、SEC-MALS、NTA、ITC和DSC屬于無標記的生物物理技術，需要最少程度的方法開發，并且可以很容易的應用于各個階段，強化了基因治療開發的分析工作流程。

 

二、高效的表征技術概念解讀

動態光散射（DLS）

動態光散射(DLS)是一種非侵入式技術，可以測量由顆粒分散體系或分子溶液引起的散射光強度隨時間的波動。由于進行布朗運動的顆粒或者分子的隨機運動，散射光的強度會隨之發生波動。使用自相關算法分析這些強度波動可以確定平移擴散系數，隨后根據斯托克斯-愛因斯坦方程確定流體力學尺寸。

多角度動態光散射（MADLS）

多角度動態光散射（MADLS）通過使用三個不同的檢測角度（背面、側面和正面）并將獲取的光散射信息組合成一個與角度無關（Angular-Independent）的粒徑分布，從而可以對多模態的樣品進行更高分辨率的尺寸測定。應用MADLS技術的擴展還可以測量出顆粒濃度（Concentration）。

電泳光散射（ELS）

電泳光散射（ELS）測定來自在電場中進行電泳的顆粒或者分子的散射光的頻移（Frequency Shift），并能夠計算出Zeta電位。顆粒的Zeta電位是顆粒在特定介質中獲得的總電荷，可用于預測分散體系的穩定性并深入了解所研究的顆粒的表面化學。

尺寸排阻色譜（SEC）

尺寸排阻色譜（SEC）是一種分離技術，可根據分子進出柱中多孔凝膠基質的流體力學半徑來分離分子。搭配一系列先進的檢測器，如光散射（LS）、UV、RI和粘度，可以測量絕對分子量、分子大小、特征粘度、支化和其他參數。

差式掃描量熱法（DSC）

差式掃描量熱法（DSC）是一種直接分析天然蛋白質或其他生物分子熱穩定性的技術，無需外在熒光素或者內源熒光，它通過測定在恒定的升溫速率下使生物分子發生熱變性過程中的熱容變化來實現。

 

案例研究 | 綜合使用多種技術表征 rAAV性狀：衣殼分子量、聚集狀態、滴度、穩定性……
 

1，空 rAAV5 衣殼分析
 

SEC-MALS (OMNI-SEC)測量產生的關鍵數據是絕對分子量，與柱保留時間或用于校準系統的任何標準無關。在空rAAV的情況下（Fig.1 和表2），主要單體的Mw為3.84 x 10⁶ g/mol。空衣殼蛋白的理論分子量為3.8 x 10⁶ g/mol，證實該分析結果符合預期。

 

圖1 rAAV5 空殼三重色譜圖

 

表2 rAAV5空殼的定量參數

 

Mw/Mn 描述樣品的分散性，接近1的值表示峰中有單個群體，遠高于1的值表示峰內有多個群體。在空 rAAV 的情況下，單體和二聚體的 Mw/Mn 值接近1，表明是單一群體。聚集體和碎片 Mw/Mn 值顯著高于1，表明單個峰內具有不同分子量的多個群體（表2）。

樣品的分數（Fraction of Sample）描述了樣本在群體之間的分布情況，在這種情況下，84.7% 的樣品是單體。蛋白質分數（Fraction of Protein）表示樣品中衣殼的百分比；在這種情況下，單體是99.8%的衣殼。這證實樣品是空的 rAAV5 。從這種單一分析方法中獲得的另一個關鍵信息是樣品滴度；在這種情況下，對于空的 rAAV5，測得的滴度為 5.91x10¹³ vp/mL。

 

2，完整 rAAV5 衣殼分析

完整 rAAV5衣殼的SEC-MALS (OMNISEC) 分析如圖2和表3所示。對于主要的單體峰，計算出的符合Mw為4.49 x 10⁶ g/mol，其中86%為衣殼。這樣，完整的rAAV5的蛋白質組分的Mw為3.86 x 10⁶ g/mol，與表2中的空rAAV5衣殼生成的數據一致。單體部分占比93%，樣品具有總滴度7.48 x 10¹³ vp/mL。

 

圖2 完整 rAAV5 的三重色譜圖

 

表3 完整 rAAV5 的定量參數

 

3，rAAV5 穩定性研究

病毒衣殼的穩定性和功能是一種平衡行為。病毒衣殼必須足夠穩定以包含和保護其中的基因組，與宿主細胞表面結合，它們必須提供足夠的構象穩定性以在復制位點釋放基因貨物。

AAV載體脫殼的機制仍然知之甚少。衣殼脫殼和基因組釋放似乎需要結構變化。基于差示掃描熒光法和差示掃描量熱法（DSC）收集的AAV熱穩定性已發表數據，AAV熱轉變的Tm值與衣殼解聚過程有關，可作為AAV血清型的鑒定指標；一種血清型的空AAV衣殼和完整AAV衣殼的Tm值通常非常相似，并且它們與衣殼動力學、衣殼脫殼和基因組釋放沒有明顯的相關性。
 

圖3 空rAAV5 和完整 rAAV5的DSC數據比較，扣除空白和基線的DSC數據。垂直方向標記的區域具有明顯不同的熱轉變過程。

 

表4 從DSC獲得的空 rAAV5 和完整 rAAV5 樣品的熱穩定性結果

 

文章中記錄的完整和空 rAAV5 樣品的DSC曲線疊加（圖3），根據空 rAAV5 和完整rAAV5 樣品的整體 DSC 圖譜差異以及熱穩定性參數（如 Tonset 和 Tm2，表 4），可以在圖 3 中 DSC 曲線上識別出四個不同的區域，它們可以暫且歸因于以下幾點：

#1■  僅在完整的 rAAV5 中出現的區域，從50℃一直延展至 75℃，這個過程大約 30 分鐘。這可能歸因于熱應激下衣殼蛋白結構和穩定性變化導致的 ssDNA 的動力學控制下的注射；

#2■在空 rAAV5 中出現的最明顯的預轉變過程；

#3■  主要轉變過程，即協同的 rAAV5 衣殼蛋白發生解組裝，這由具有血清型特異性的 Tm 值所決定；

#4■  僅在完整 rAAV5 中出現的另外的轉變過程，很可能歸因于 ssDNA 的解鏈。

結論：以上幾例是綜合應用馬爾文帕納科多種互補技術對基因治療常用的AAV載體一些關鍵屬性的表征，這些無標記生物物理技術需要最少的方法開發，可以從衣殼設計階段到開發、配方開發和藥物原料和產品進行深入表征，加強體內基因治療開發的分析工作流程。

 

詳細內容可參文獻 (Pharmaceutics 2021, 13(4), 586; https://doi.org/10.3390/pharmaceutics13040586）

[1] Burnham, B.; Nass, S.; Kong, E.; Mattingly, M.; Woodcock, D.; Song, A.; Wadsworth, S.; Cheng, S.H.; Scaria, A.; O’Riordan, C.R. Analytical ultracentrifugation as an approach to characterize recombinant adeno-associated viral vectors. Hum. Gene Ther. Methods 2015, 26, 228–242

 

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