微生物培養基優化方法的研究進展！


微生物初級代謝產物和次級代謝產物的生物合成與培養基組成和培養條件密切相關，而在一個高度非線性、非結構化的復雜系統中要獲得最佳工藝，試驗優化技術具有很重要的作用。本文綜述了單因子試驗、正交試驗、均勻設計、響應面設計、遺傳算法和神經網絡等優化技術并進行了展望。

微生物發酵是指微生物利用一些原料養分在合適的發酵條件下經特定的代謝途徑轉變成所需產物的一類復雜的生物過程，涉及到許多相互影響的因素，產物生物合成水平除受微生物內部代謝機理、調控機制等影響外，還有外界環境(培養基組成與配比、發酵溫度 、發酵pH、溶氧等)的影響 。因此，最大限度地合成目的產物并非易事，并且對于一個高度非線性、非結構化的復雜發酵系統而言，要建立一個準確、滿意的合成模型則更為困難，而試驗優化技術的應用，特別是多元方程擬合技術(響應技術)的應用可以很好地解決該問題。傳統的優化技術(如單因素法)雖然方法簡單、易行，結果較直觀，但在考察多個因素時會浪費大量時間，且有可能導致不可靠的甚至錯誤的結論，因此，常常僅作為過程優化的初步試驗。在考察多個因素時，為了減少試驗次數，節省時間，通常采用統計優化技術，這是因為統計優化技術無論從試驗設計到數據分析以及模型的建立與統計學密切相關，它能夠以較少的試驗次數獲得極為豐富的統計信息。因此，被廣泛地應用于微生物發酵培養基配方的優化中，以確定最佳發酵工藝參數，從而實現高產、優質、低消耗等經濟目標，本文對常用的優化試驗方法進行了綜述。

一、單因素試驗法

單因素試驗是在假設因素間不存在交互作用的前提下，通過一次只改變一個因素且保證其他因素維持在恒定水平的條件下，研究不同試驗水平對結果的影響，然后逐個因素進行考察的優化方法，是試驗研究中最常用的優化策略之一。王曉輝等人利用單因素試驗對BS070623蛋白酶高產突變株進行了發酵培養基優化試驗，取得了良好效果。然而，對于大多數培養基而言，其組分相當復雜，僅通過單因素試驗往往無法達到預期的效果，特別是在試驗因素很多的情況下 ，需要進行較多的試驗次數和試驗周期才能完成各因素的逐個優化篩選，因此，單因素試驗經常被用在正交試驗之前或與均勻設計、響應面分析等結合使用。利用單因子試驗和正交試驗相結合的方法，可用較少的試驗找出各因素之間的相互關系，從而較快地確定出培養基的最佳組合。較常見的是先通過單因素試驗確定最佳碳、氮源，再進行正交試驗，或者通過單因素試驗直接確定最佳碳氮比，再進行正交試驗。

二、正交設計試驗法

正交設計試驗法是利用一套表格，設計多因素、多指標、多因素間存在交互作用而具有隨機誤差的試驗，并利用普通的統計分析方法來分析試驗結果。正交設計試驗法對因素的個數沒有嚴格的限制，而且無論因素之間有無交互作用，均可使用。利用正交表可于多種水平組合中，挑出具有代表性的試驗點進行試驗，它不僅能以全面試驗大大減少試驗次數，而且能通過試驗分析把好的試驗點(即使不包含在正交表中的)找出來。利用正交設計試驗得 出的結果可能與傳統的單因素試驗法的結果一致，但正交試驗設計考察因素及水平合理、分布均勻，不需進行重復試驗，誤差便可估計出來，因而計算精度較高，特別是在試驗因素越多 、水平越多、因素之間交互作用越多時，優勢表現越明顯，此時，使用單因素試驗法幾乎不可能實現。孟和畢力格等人利用正交試驗對傳統乳制品中產γ-GABA乳酸菌培養基進行了優化，獲得了滿意結果，采用優化后的培養基于32℃發酵培養 96 h，產物含量高達10.78 g／L。鐘為章等人采用L16正交表對紅螺菌科光合細菌液體培養基組成進行了優化，利用優化培養基在光照3000 lx、(32±2)℃條件下培養3d，細菌總數由1.63×109cfu／mL增殖至3.68x10 cfu／mL。蔡成崗等人以角蛋白酶為考察指標，采用正交試驗對枯草芽孢桿菌菌株KD—N2生產角蛋白酶培養基進行了優化研究，產物酶活力可達到(66.5±2.04)U／mL。在正交試驗中，如果所考察的指標涉及到模糊 因子時，不能直接使用正交設計試驗法，可以把正交試驗結果模糊化，然后用模糊數學的理論和方法處理試驗數據。陳敏等人利用模糊正交法，把試驗結果模糊化，以模糊綜合評價值為目標函數優化了鋅酵母發酵培養基組成。模糊正交法通過把正交試驗結果模糊化，然后用模糊數學的理論和方法處理試驗數據，不僅能估計因素的主效應，還可以估計因素的最佳搭配，能在同樣試驗工作量情況下獲得更多的信息。

三、均勻設計法

均勻設計法(Uniform Design)是一種考慮試驗點在試驗范圍內充分均勻散布的試驗設計方法，其基本思路是盡量使試驗點充分均勻分散，使每個試驗點具有更好的代表性，但同時舍棄整齊可比的要求，以減少試驗次數，然后通過多元統計方法來彌補這一缺陷，使試驗結論同樣可靠，均勻設計一般采用二次型回歸模型：由于每個因素每一水平只作一次試驗，因此，當試驗條件不易控制時，不宜使用均勻設計法。對波動相對較大的微生物培養試驗 ，每一試驗組最好重復 2～3次以確定試驗條件是否易于控制，此外，適當地增加試驗次數可提高回歸方程的顯著性。均勻設計法與正交設計試驗法相比，試驗次數大為減少，因素、水平容量較大，利于擴大考察范圍，如當因素數為5，各因素水平為3l的試驗中，如果采取正交設計來安排試驗，則至少要做312=961次試驗 ，而用均勻設計只需要做31次試驗。在試驗數相同的條件下，均勻設計法的偏差比正交設計試驗法小。在使用均勻設計法進行條件優化時，應注意幾個問題：①正確使用均勻設計表，可參考方開泰制定的常用均勻設計表，每個均勻設計表都應有一個試驗安排使用表，要注意變量、范圍和水平數的合理選擇。②不要片面追求過少的試驗次數，試驗次數最好是因素的3倍。③要重視回歸分析，為了避免回歸時片面追求回歸模型的項數、片面追求大的R2值和誤差自由度過小等問題，可通過選擇n稍大的均勻設計表，誤差自由度≥5，回歸模型最好不大于l0，在已知實際背景時少用多項式，在采用多項式回歸時盡量考慮二次的。④善于利用統計圖表，在均勻設計中，各種統計點圖，如殘差圖、等高線圖、正態點圖、偏回歸圖等，對數據特性判定和建模滿意度的判斷非常有用。⑤均勻設計包的使用，如 DPS、SPSS、Sigmaplot、SAS等。王劍鋒等人利用均勻設計、二次多項式逐步回歸分析對煙管菌 Bjerkandera adusta WZFF．W—Y11產漆酶液態發酵培養基進行優化，在優化條件下進行液態培養可穩定獲得 9672U／L的漆酶活力。

四、響應面優化設計法

響應面優化設計法是一種尋找多因素系統中最佳條件的數學統計方法，是數學方法和統計方法結合的產物，它可以用來對人們受多個變量影響的響應問題進行數學建模與統計分析 ，并可以將該響應進行優化。它能擬合因素與響應間的全局函數關系，有助于快速建模，縮短優化時間和提高應用可信度。一般可以通過 Plackett—Burman (PB)設計法或 Central composite design (CCD)等從眾多因素中精確估計有主效應的因素，節省實驗工作量。響應面分析法以回歸法作為函數估算的工具，將多因子試驗中因子與試驗結果的相互關系，用多項式近似，把因子與試驗結果(響應值)的關系函數化，依此可對函數的面進行分析，研究因子與響應值之間、因子與因子之間的相互關系，并進行優化。周海鷗等人應用 PB設計法對影響桑黃發酵的培養基組成進行篩選，再采用 CCD設計結合響應面對影響菌絲得率的關鍵因素最佳水平進行了深人研究，并通過二次方程回歸求解得到最優化條件，此模型與預測值極為接近，吻合性較好。姜麗艷等人應用PB設計法對影響乳鏈菌肽液體發酵培養基組分進行了篩選，然后采用最陡爬坡實驗逼近 3個關鍵因素的最大響應區域 ，找到了最優化的水平，在此培養條件下進行發酵培養，發酵液中乳鏈菌肽效價為 6033 U／mL，是優化前的4．48倍。鐘國華¨蜘等人采用中心組分旋轉設計技術，根據菌絲干重和高效氯氰菊酯降解率，按照統計學要求檢測模型顯著性，分析了配方組合對降解菌生長量、高效氯氰菊酯降解率的影響和效應，采用二次多項式逐步回歸分析模型，根據響應面模型和預測回規模型方差分析對模型進行評價，以確定最佳培養基配方。利用優化培養基進行培養，菌體干重為 450.30 mg／50 mL培養菌液，處理24 h對50 mg/L 高效氯氰菊酯降解率高達93.78％。王普等人用部分因子試驗篩選了影響 Candida tropicaJis 104產高選擇性羰基還原酶的因素，繼而采用最陡爬坡路徑逼近最大響應區域并結合CCD和RSM對3個顯著性因素進行分析，得到了優化的培養基組成，采用該優化培養基進行發酵培養，供試菌株羰基還原酶活力達到 851.13 U／L，較優化前提高了65.2％。

五、二次正交旋轉組合法

前面介紹的幾種方法具有試驗設計和結果分析簡單、實際應用效果好的優點，在微生物培養基優化中得到了廣泛的應用，但它們不能對各組分進行定量分析，不能對產量進行預測。所以，在正交設計試驗法的基礎上，加入組合設計和旋轉設計的思想，并與回歸分析方法有機結合，建立了二次回歸正交旋轉組合設計法(rotation regression orthogonal combination)，它是旋轉設計的一種，不僅基本保留了回歸正交設計的優點，還能根據測量值直接尋求最優區域，適用于分析參試因子的交互作用。它既能分析各因子的影響，又能建立定量的數學模型，屬更高層次的試驗設計技術。基本思路是利用回歸設計安排試驗，對試驗結果用方程擬合，得到數學模型，利用計算機對模型進行圖形模擬或數學模擬，求得模型的最優解和相應的培養基配方，并在一定范 圍內預估出在最佳方案時的產量，與響應面法有相似之處。張鐘元等人為了提高 Proteus mirabilis產 L-肉堿脫水酶的活力，通過單因素試驗研究了碳源、氮源及誘導物等對酶生物合成的影響的基礎上，采用二次正交旋轉組合設計優化了培養基組分配比，使L-肉堿脫水酶活力由最初的1.90 U／mL提高到了5.32 U／mL，與模型預測值較為接近，取得了預期效果。劉曉永等人為提高酵母菌中β- 葡聚糖的含量，在單因素試驗基礎上，應用二次正交旋轉組合法設計培養基成分，獲得了優化后的培養基配方，培養基經優化后，酵母菌中B一葡聚糖產量由原來的65.80 mg／100 mL提高至108.18mg／100 mL，獲得了滿意的結果。

六、遺傳算法與神經網絡

遺傳算法(genetic algorithms，GA)是一新型智能優化算法，由美國的Holland提出，是進化算法(evolutionary algorithms，EA)中的一種，是基于達爾文的進化論和孟德爾的遺傳學說，仿效生物的進化與遺傳，根據“生存競爭” 和“優勝劣汰”的原則，借助復制、交換、突變等操作，使所要解決的問題從初始解一步步逼近最優解，遺傳算法模擬生物遺傳和進化原理，在反復迭代的過程中，將適應度高的個體更多的遺傳到下一代，為確保在整個n維空間搜索最優解，群體由一定數量的個體組成，在遺傳的同時，個體在一定的概率下發生交叉互換，并在一定的概率下發生變異，所以，將在最終的群體中得到一個或若干個優良的個體，其對應的表現型即為達到或接近問題的最優解，培養基配方優化的遺傳算法基本過程見圖 l，遺傳算法在整個可行域內進行隨機尋優，并對搜索空間的多個解進行評估，能有效防止搜索過程限于局部最優解，最終達到或逼近全局最優解。最早報道 GA應用于培養基優化的是 Freyer等，其后 Zuzek等也進行了嘗試，由于它在培養基優化方面不需要建立數學模型確定各因素之間的相互影響，有目標函數值即可的優越性而受青睞。與其他傳統搜索方法相比，GA在搜索過程中不易陷入局部最優，即使所定義的目標函數非連續、不規則或伴有噪聲，它也能以很大的概率找到全局最優解，同時，由于GA 固有的并行性，使得它適合于大規模的并行分布處理，而且GA容易介入到已有的模型中并且具有可擴展性，易于和其他技術如神經網絡、模糊推理、混沌行為和人工生命等相結合，形成性能更優的問題求解方法∞。運用配方優化的遺傳算法所搜索出的決策因素最優區間，可以免饋到進一步的配方試驗中，有效地縮短確定優化配方的時間與減少試驗次數。神經網絡是一種“黑箱”模型，具有很強的非線性映射能力，可用于反 映非線性條件下，難以用常規的數學模型描述的問題。遺傳算法以自然選擇和遺傳理論為基礎，將生物進化過程 中適者生存規則與群體內部染色體的隨機信息交換機制相結合的高效全局尋優搜索算法。神經網絡和遺傳算法的結合可 以通過引入非線性的模型來描述各因素問復雜的關系，并在遺傳算法的基礎上，通過全局尋優找出最佳值。羅劍飛等人利用神經網絡(ANN)和遺傳算法(GA)結合的優化方法優化了培養其組成，并獲得了最高“性價比”的培養基，通過發酵經濟學的初步統計發現，優化后的培養基比初始培養基，其“性價比”提高了27.36％。試驗表明，通過優化可以大大減少生產中的成本消耗。宋文軍等應用GA優化了L—Ile發酵培養基組成，并運用ANN技術對發酵過程進行建模并預測 ，取得了良好效果，實驗發現，在L—Ile 發酵的模擬和預測是一種快速方法。

七、模式識別

模式識別方法是從空間區域劃分和屬性類別判斷角度出發，處理多元數據的一種非函數方法。該方法用一組表示被研究對象特征的變量構成模式空間，按 “物以類聚”的觀點分析數據結構，劃分出具有特定屬性模式類別的空間聚集區域 ，并辨認每一個模式的類別。由計算機按模式識別原理處理數據信息，做出最優決策。熊明勇等人應用模式識別，以培養基組成構筑模式空間，以黃色短桿菌 TV10為出發菌株，通過主成分分析(PCA)揭示模式空間的可視化區域，選擇優化點并逆推回到高維空間得到最優化培養基組成，結果表明，該菌株可積累一纈氨酸26.38 g／L，比初始值提高7.8％。

八、展望

微生物初級代謝產物和次級代謝的生物合成其發酵機理十分復雜，受很多因素的影響，如培養基組成、培養溫度、pH、發酵時間、菌種理化特性及發酵工藝等。適宜的培養基配方和合適的發酵條件成為產物生成量高低和原料利用率高低的決定因素。一般情況下，培養基組分繁多且各成分間還可能存在錯綜復雜的交互作用。因此，微生物培養基的組成優化就顯得十分重要和必要。培養基優化常規方法有單因素試驗法、正交設計試驗法及響應面分析法，還有一些實踐應用相對較少的，如均勻設計法、二次回歸旋轉組合法、遺傳算法等。培養基優化方法的選擇，可以采取單一方法 ，也可以用幾種方法的組合，要根據實際情況合理選擇。培養基優化方法除本文中提到的常用培養基優化方法外，還有研究者不斷開拓新方法或采用不同方法交叉對培養基進行優化，如聚類分析方法等。筆者相信，隨著數理統計方法和優化技術的發展和應用，將來一定還會出現更適用、更方便、可行性更好的微生物培養基優化方法。