在生物應用中，一個廣泛討論的話題是樣本冷凍過程和最終保存和儲存溫度對生物樣本穩定性的影響。為了將生物材料保存在其最佳狀態，必須采用慢速冷凍過程，并將儲存溫度控制在絕對最低值。這些指南已得到普遍認可，但這一過程背后的原理卻鮮少有人詳細闡述。本白皮書的目的是為這些操作的科學依據及其對生物材料生存能力的影響提供背景資料。

樣本儲存過程通常被稱為生物保存，由四個階段組成：制備、冷卻、儲存和解凍。這些階段通過“被稱為低溫連續介質的細胞所經歷的深化低溫應激之旅”緊密相連，其中在一個階段中發生的事件會影響上下游的相鄰階段 1。生物保存的最終目的是將樣本置于生命暫停狀態，使其能夠在功能齊全的條件下恢復。這一過程對包括細胞、組織、細菌、病毒和分離的亞細胞成分（細胞器、DNA、 RNA、蛋白質）在內的各種樣本類型都非常有效，但也可能會產生一些負面影響。可分為兩類： 1) 物化-滲透壓和 2) 生化/分子^2,3。最終，如果下游分析顯示樣本質量下降，則在解凍后可以觀察到這些作用產生的結果。在細胞或組織樣本中，這被視為產率或生存能力、功能、繁殖能力的降低以及遲發性凋亡和壞死誘導。在細菌、病毒、亞細胞器、 DNA、 RNA 或蛋白質樣本中，數量、質量、純度等的下降往往是次最優生物保存的結果。

所有生物保存都需要將樣本的溫度從常溫（通常為 37 °C）降低到最終儲存溫度 1,3。在冷卻階段前，將樣本放入含有低溫保護劑（DMSO、甘油、乙二醇、糖等）的介質中，并在大約 4 °C 下保持幾分鐘（<30 分鐘），以達到平衡。樣本冷卻在大約-1 °C/min的受控速率下完成，以實現哺乳動物細胞的最佳保存 4。對于細菌、病毒和分離的亞細胞成分（細胞器、 DNA、 RNA 和蛋白質），在受控速率下冷卻不會遇到太大的問題。在受控速率下冷卻減少體積偏移，并允許水流從細胞進入細胞外環境 4-7。這會導致細胞脫水和細胞內溶質（鹽、離子、低溫保護劑等）的冷凍濃縮，并降低胞內冰形成的可能性。

細胞持續脫水，直到溫度降低到玻璃轉換溫度(Tg)以下，即樣本轉變為玻璃態（純水的Tg 約為-135 °C） 8。
 

雖然細胞脫水對于降低胞內冰形成的概率非常有利，但是當樣本儲存在高于 Tg的溫度下時，脫水將在整個儲存期間持續進行，造成更大的損傷。隨著樣本繼續脫水，會對細胞膜、細胞器、蛋白質和核酸造成結構性損傷 1。這種損傷可能對樣本造成幾個方面的危害，包括激活延遲分子修復或降解途徑（凋亡、壞死、未折疊蛋白反應(UPR)、DNA 修復等），如果損傷過于嚴重，則可能會在解凍后立即導致樣本損耗⁹。

除了冷凍對樣本產生的物理影響，在分子層級上也會產生影響，這是由如下幾個因素造成的： 1)可用能量和代謝活動的減少； 2)生化途徑的解偶聯； 3)應激反應途徑的激活^9,10。在儲存過程中，在降低的動能水平下（降低 10 °C 相當于可用熱能降低 3 %），溫度的降低會導致新陳代謝和生化途徑的減慢1。對于哺乳動物細胞，一個衡量新陳代謝總變化量平均值的簡單方法是 Q10，溫度每下降 10 °C（Q10為 2），新陳代謝（耗氧量）減少大約 50%^11,12。
 

本質上，無論溫度如何，低溫儲存會減慢所有細胞的生化反應，但不會停止，除非溫度低于 Tg。由于生物化學過程和途徑與溫度有關，即使在-20 °C 和-80 °C 下，生物化學反應仍會發生，導致對樣本造成持續性損傷，無論是細胞、亞細胞成分、 DNA、RNA、蛋白質、細菌還是病毒。這些反應通常是不受控制和不完整的，會導致有毒中間化合物的形成和積累，例如自由基、厭氧代謝副產物以及由于必要的回收途徑或反應所需的溫度抑制而無法清除的廢物。這些副產物可能會導致直接損傷或解凍后分子應激反應的激活¹⁰。使這一等式更加復雜的是，樣本所經歷的許多應激源在解凍時會引發分子死亡或生化降解級聯反應，即使不會立即致死。這些因素包括代謝解偶聯、自由基生成、細胞膜結構和流動性的改變、細胞離子平衡失調、細胞內鈣庫中鈣的釋放、滲透通量和低溫保護劑的暴露。例如，在儲存過程中自由基的生成和積累會直接損傷細胞和分離樣本中的 DNA、蛋白質和線粒體的完整性 9,13,14。除了物理影響，自由基的積累還會激活 UPR 和凋亡途徑，導致樣本進一步降解 15。在許多情況下，在生物保存過程中這些亞致死應激源的積累會導致細胞凋亡的激活，隨后由于缺乏能量以及在解凍時應激源的不斷“積聚”而發展為繼發性壞死。這種亞致死損傷的表現在解凍后可能不明顯，可能需要幾個小時到幾天的時間才能檢測到 2,3。
 

如上所述，儲存期間的損傷在物理和分子層級上持續發生。在物理上，樣本持續經受由冷凍誘發的脫水和溶質濃縮影響，造成持續和加深的損傷。在生物化學上，反應持續進行，盡管速率大幅降低。在 Q10 為 2 的條件下，與 37 °C (100 %)時相比， 4 °C 時耗氧速率估計為 6 %， -20 °C 時為 1.6 %，-40 °C 時為 0.5 %， -70 °C 時為 0.05 %，-80 °C 時為 0.02 %。理論上講，這一過程將持續到 Tg 達到所有生化反應停止為止。雖然大幅降低，在長期儲存期間這種生化活性仍較為顯著。例如，從能量和/或耗氧量計算的角度來看，在-80 °C 下儲存 40 天相當于在 37 °C 下儲存 1 天（在-80 °C 下儲存 1 年相當于在 37 °C 下儲存約 9 天）。應注意，基于溫度的生化活性抑制并不普遍，因為各個途徑、過程和反應的反應各不相同 16。因此，雖然受到高度抑制，但生化過程仍在繼續，但以一種解偶聯和不受控制的方式進行，從而導致樣本持續降解。隨著儲存溫度和間隔時間的增加，這些應激事件會在樣本中放大。各個途徑、過程和反應對長時間儲存的具體反應還不清楚，但人們普遍認為，儲存溫度對在發現明顯損傷之前的樣本儲存時間有著很大的影響 17,18。例如，在哺乳動物細胞中，在給定溫度下儲存時間的范圍為： 4 °C 下儲存不到一周； -20 °C 下不到一個月； -70 °C 和-80 °C 下不到 6-12 個月。儲存-196 ºC 的液氮中可有效防止所有熱驅動的化學反應，只有電離輻射驅動的活動才能在該溫度下進行。據估計，可能需要幾千年才能注意到對冷藏保存的培養基的可測量影響 19,20。根據報告，細菌、病毒、 DNA、 RNA 和蛋白質樣本可在-80 °C 下儲存 1-2 年（或更長時間）。必須注意，這些保存時間僅供參考，單個樣本的保存時間應通過檢查解凍后特定于預期最終用途的適當參數確定。此外，這些儲存時間以最終溫度下的穩定保存為基礎。在任何溫度下將任何樣本反復凍融都會導致樣本加速降解。
 

樣本對冷凍過程的持續物理、生化和分子反應對其質量有很大的影響。在細胞、細菌和病毒樣本中可以經常觀察到產率、生存能力、功能和繁殖能力的降低，而 DNA、 RNA和蛋白質樣本在數量、質量和反應性方面的下降是常見的。假設按照既定的方案解凍樣本，質量下降是冷凍和儲存過程中應激和降解的直接結果。由于樣本在儲存過程中不斷損傷，樣本儲存的時間越長，儲存溫度越高，樣本降解的程度就越大。如果樣本要長時間儲存，最好保存在最低可行的溫度下。可在液氮中實現最佳儲存，即-196 ºC，此時所有生化反應均停止。考慮到在常規冷凍過程中所發生事件的復雜性，必須要了解樣本制備、冷卻、儲存溫度、儲存時間和加熱對樣本整體質量的影響。要獲得在給定溫度下冷凍和儲存的好處，需要權衡單個樣本的最終儲存目標（時間、最終用途、樣本復雜度等）。

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