01.準備

• Article（文章）Prefrontal cortical regulation of brainwide circuit dynamics and reward-related behaviorIncubation of Cocaine Craving After Intermittent-Access Self-administration: Sex Differences and Estrous Cycle
• Materials and Reagents（材料與試劑）實驗分組：對照組，自主給藥時給生理鹽水。實驗組，自主給藥時給受試藥物。
• Equipment （儀器設備）
  Lafayette斯金納箱-自主給藥系統

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02.Principle（原理）

自主給藥系統（自身給藥實驗）是行為藥理研究的常用方法，它利用某些藥物的正性強化作用，通過一定條件控制，使動物建立起行為與獎賞之間的聯系，從而模擬人類藥物濫用的一些情況。

1954年，詹姆斯·奧爾茲和皮特·米爾納最先認識到腦內存在獎賞系統并運用動物自主給藥系統：按壓按鈕使大鼠接受大腦中的對特定部位短暫的電刺激。

獎賞環路的分類

正性獎賞環路（增大獎賞效應）和負性獎賞環路（抑制獎賞效應），此處主要介紹正反饋自主給藥實驗。

1、正性獎賞環路

中腦邊緣多巴胺（Dopamine，DA）系統是獎賞環路的中心。該系統主要起源于兩個腦區：中腦腹側被蓋區（ventral tegmental area，VTA）和黑質致密部（Substantial nigra pars compacta，SNpc）。VTA多巴胺能神經元主要投射到伏隔核（Nucleus Accumbens，NAcc）、內側前額葉皮層（Medial Prefrontal Cortex）和基底外側杏仁核（basolateral nucleus of amygdale，）。此外，基底外側杏仁核的谷氨酸能神經元可以通過 NAcc 間接投射到VTA。內側前額葉皮層也能投射到VTA，這些腦區共同構成了正性獎賞環路。其中，VTA富含多巴胺能神經元，是調控獎賞功能的主要區域，這就是獎勵對動物神經內分泌的作用的體現之一。

2、負性獎賞環路

研究表明LHb接收來自蒼白球、下丘腦和前扣帶回等腦區的輸入，然后投射到VTA的多巴胺能神經元。這些通路共同構成了負性獎賞環路。外側韁核（lateral habenula，LHb）是負性獎賞環路的主要區域。研究發現，向猴子進行厭惡刺激會強烈激活LHb神經元；用光遺傳方法激活大鼠腳內核到LHb的輸入會使得大鼠厭惡、逃避所探索的環境。這表明在嚙齒類動物和非人靈長類動物中LHb均參與處理和編碼厭惡信息，提示我們可通過激活LHb來抑制獎賞效應，從而治療藥物成癮、抑制動物刻板行為的目的。

03.Procedure （方法步驟）

適應期

1. handle動物3-7天，使動物適應被抓取，不會產生過大的應激反應

學習期

1. 斯金納箱預設程序，壓桿一次給予糖水獎勵（比較簡單，無需禁食），每個實驗周期設為10分鐘或壓桿20次；
2. 將動物放入斯金納箱進行學習，每天1次；
3. 動物10分鐘內按壓壓桿20次，且按壓后進入食槽獲得獎勵概率大于85%，穩定重復2天，視為學會壓桿；
4. 當有滿足分組數量足夠多的動物學會壓桿操作后（每組額外預留多只動物，后續仍會有淘汰階段），結束學習期，淘汰沒有學會壓桿的動物（淘汰動物可以用于其它實驗）。

實驗期

1. 對所有學會壓桿的動物進行靜脈埋管；
2. 埋管后重復一天斯金納箱學習實驗，剔除埋管導致壓桿行為喪失的動物；
3. 將剩余動物按照實驗需要進行分組；
4. 斯金納箱預設程序 ，壓桿一次給予藥物注射一定時間，藥物依據分組不同而不同。每個實驗周期設為10分鐘；
5. 將動物放入斯金納箱中進行實驗，每天1次，共計2天。

04.檢測數據

實驗期動物按壓壓桿的次數。

正性獎賞環路實驗中，對照組一般注射溶劑或者生理鹽水等動物不會產生成癮反應的液體，動物會在實驗過程中發生行為消退，兩次實驗過程中按壓壓桿次數會減少。若藥物對于動物有成癮作用，則動物會視藥物注射為獎勵，壓桿操作則不會因為消退而導致減少，甚至可能會產生更多次的按壓行為。負性獎賞環路實驗中，對照組一般注射容易讓動物產生成癮反應的液體，從而動物在實驗過程中不易發生行為消退，兩次實驗過程中壓桿次數不會減少，甚至會增多。若受試藥物對此有抑制作用，則動物會發生行為消退，兩次實驗過程中按壓壓桿次數會減少。

05.數據分析方法

*注意事項

1. 觸鼻和壓桿是兩種經典斯金納箱常用響應方式。之所以選擇壓桿而不是觸鼻進行實驗，是因為觸鼻是動物本來就存在的一種行為，造模相對會比較類似于經典條件反射。
2. 實驗期應對動物食槽進行遮擋，避免動物進入食槽時可能會扯掉給藥導管。
3. 如果需要同時評估藥物除了成癮外的其它功能，如對動物記憶、注意力的作用等，則需使用更為復雜的斯金納箱應用程序來進行實驗，實驗周期也會有所延長。若受試藥物為興奮劑類型的藥物，動物可能會進入過度亢奮的狀態，產生如四處亂跳等亢奮行為，會對壓桿操作有一定的影響。此時建議結合視頻錄制來觀察動物狀態，確定藥物是否有成癮傾向

01.準備

• Article（文章）Prefrontal cortical regulation of brainwide circuit dynamics and reward-related behaviorChemogenetic inhibition of lateral habenula projections to the dorsal raphe nucleus reduces passive coping and perseverative reward seeking in rats
• Materials and Reagents（材料與試劑）糖精、清潔水、千分秤
• Equipment （儀器設備）Lickometer舔舐行為測試系統

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02.Principle（原理）

糖水偏好測試是一項簡單的任務，用于評估嚙齒動物模型中的動機、抑郁(和無快感)及相關情緒狀態，也用于更復雜的模型，如產后抑郁癥和停藥等。

1981年，Katz等人首次在抑郁大鼠造模過程中發現，應激后的大鼠蔗糖和糖精水的消耗減少達50%，并進一步發現三環類抗抑郁藥丙咪嗪可顯著增加模型組大鼠糖水的消耗量，隨后Willner等使用糖水偏好實驗對CUMS（Chronic unpredictable mild stress，慢性輕度不可預見刺激應激模型）大鼠進行評價，發現隨著應激時間的延長和應激強度增加，模型大鼠的糖水消耗率明顯下降，且該結果可被抗抑郁藥物去甲丙咪嗪改善。該實驗同時排除了大鼠糖水消耗減少是出于熱量調節失調或應激后血糖升髙引起糖水攝入量降低的猜想。此重要發現說明了內源性抑郁癥的核心特征是獎勵機制缺陷和快感缺乏。現代研究表明，作為中腦“獎勵中心”的單胺核團，多巴胺系統邊緣通路與獎賞機制有關叫外側韁核則是大腦的“反獎勵中樞”，其簇狀放電方式增強了對腹側被蓋區與中縫背核的抑制，進而導致了快感缺失與行為絕望，是抑郁癥發生的充分條件。

03.Protocol （方法步驟）

1. Day1-3：適應實驗房間（單籠飼養，雙飲水瓶均裝潔凈自來水，自由飲水攝食）；Handle（5min/天將動物放在手上輕柔把玩）（測試開始于測試結束時均要稱量記錄水瓶重量）；
2. Day4：雙瓶均為水（測試開始與測試結束時均要稱量記錄水瓶重量，剔除有飲水偏好的動物）；
3. Day5：雙瓶均為1-2%糖水（測試開始與測試結束時均要稱量記錄水瓶重量）；
4. Day6：8am-2pm進行實驗，動物可自由攝取兩瓶水/糖水（測試開始與測試結束時均要稱量記錄水瓶重量）。

04.數據分析方法

糖水比例（%）=【糖水攝入量/（糖水攝入量+水攝入量）】*100%同時也可以分析舔舐次數變化。

*注意事項

1. 水瓶滴漏：避免水瓶地漏，造成稱量重量出現偏差
2. 品系差異：如，李斯特（Lister）帶帽的大鼠在濃度為1％時顯示出明顯的蔗糖偏愛，而威斯塔（Wistar）大鼠則沒有。與C57BL / 6J小鼠相比，129P3 / J小鼠對蔗糖或麥芽糊精加糖溶液的偏愛性較低
3. 性別差異：如，Wistar Kyoto雄性大鼠的蔗糖偏愛率低于雌性。京都Wistar雄性大鼠表現出應激誘導的蔗糖偏愛損失，而雌性則沒有。相反，雄性和雌性Sprague Dawley大鼠在慢性輕度應激后均表現出蔗糖偏愛的降低