微生物多樣性測序在證明腸道菌群移植可改善心房顫動（AF）的應用

瀏覽次數：1070　發布日期：2021-6-8　來源：本站　僅供參考，謝絕轉載，否則責任自負

文章標題：Gut microbiota dysbiosis promotes age-related atrial fibrillation by lipopolysaccharide and glucose-induced activation of NLRP3-inflammasome

發表期刊：Cardiovascular Research

影響因子：IF=8.168

合作客戶：哈爾濱醫科大學附屬第一醫院

百趣生物提供服務：16S（可點擊了解詳細信息）

1.圖片摘要

腸道菌群失調導致緊密連接蛋白ZO-1、claudin-4、occludin等表達水平降低，導致腸道通透性增加，LPS趁機進入循環，這可能導致糖耐量受損。進而LPS和葡萄糖過量增強心房NLRP3炎癥小體活性，導致纖維化心房結構重塑。

2.研究簡介

老齡化是心房顫動(AF)發病率增加的最重要因素。腸道菌群失調與年齡相關的疾病有關。本研究通過使用糞便菌群移植(FMT)大鼠模型證明了老年大鼠的房顫易感性可以傳遞給年輕宿主。循環脂多糖LPS和葡萄糖水平的顯著增加導致NOD樣受體蛋白(NLRP)-3炎癥體的上調表達，促進房顫的發展（取決于受體宿主心房纖維化的增強）。

tip：心臟纖維化的進展降低了心房和心室的順應性，并破壞了正常有序的導電結構。這最終導致心臟的舒張和收縮功能受損，并最終導致心律失常。

臨床研究發現與年輕患者相比，老年患者血清脂多糖和葡萄糖水平均逐漸升高。在臨床房顫患者中也證實了循環脂多糖和葡萄糖水平、腸道結構和大鼠心房NLRP 3-炎癥體的衰老特征。最后，移植年輕腸道菌群的老齡大鼠恢復了腸結構和心房NLRP 3-炎癥體活性，這抑制了與老齡相關的房顫的發展。

研究描述了腸道菌群失調在年齡相關性房顫發病機制中的新因果作用，表明微生物群-腸道屏障-心房NLRP3炎癥小體軸可能是治療年齡相關性心律失常疾病的合理分子靶點。

實驗動物：雄性大鼠

分組：對照組，young-FMT，aged-FMT

實驗：分子實驗（WB,OGTT,免疫共沉淀），16S擴增子（糞便），蛋白質組學（結腸組織）。

3.主要內容

1. 老齡化改變腸道菌群組成并促進房顫易感性

首先借助心房電生理試驗（對老年組和年輕組大鼠）驗證了老齡化確實影響大鼠對房顫的易感性。并且作者通過16S rDNA研究了老年和年輕大鼠的糞便菌群。兩組間微生物群落結構因年齡而顯著分離。在門的水平上，隨著年齡的增長，螺毛類增加，疣粒菌減少。厚壁菌門與擬桿菌門的比率（F/B比率，腸道微生物生物失調的指標）顯著降低，在科、屬水平上腸道菌群組成的也有顯著變化。房顫易感性的增加與老年過程中腸道生物失調的發展密切相關。

2. 老年大鼠腸道菌群移植增加年輕大鼠對房顫的易感性

為研究腸道菌群在與年齡相關的房顫中的作用，對年輕大鼠進行了持續6周的FMT試驗。未加權主成分分析顯示，young-FMT組和aged-FMT組之間的微生物群是分開的。屬水平的top15差異菌群表明移植后大鼠的腸道菌群成功地向老齡化表型轉移。結果表明，與年齡相關的FMT成功地改變了年輕大鼠的腸道微生態。但兩組體重無顯著差異。

與年輕的FMT大鼠相比，aged-FMT組大鼠具有明顯更高的誘發率和更長的房顫持續時間。然而，兩組之間AERP（房顫發生的重要基礎）沒有差異。此外，馬森三色染色（組織學染色方法）顯示aged-FMT組大鼠的心房纖維化明顯增加。TGF-β1和α-SMA在心房中的表達水平顯著增加，兩種纖維化相關標志蛋白也被證實。此外，在aged-FMT組組的心室中沒有觀察到顯著的纖維化。綜上所述，年齡相關的微生物失調會導致房顫的易感性增加。

圖1 老年大鼠腸道菌群成功在受體大鼠中重新定植并促進AF易感性

3. 隨著年齡的增長，微生物來源的脂多糖增加，促進房顫

腸道菌群可以通過產生活性代謝物影響宿主生理活動，如TMAO、脂多糖、膽汁酸等。脂多糖水平（circulating LPS）隨著年齡的增長而增加，并在與年齡相關疾病的炎癥過程中起重要作用。因此推測脂多糖可能通過介老齡化過程中的心房炎癥而促進房顫。為了確定脂多糖在年齡相關性房顫中的作用，作者收集了1152名人類獻血者的血漿樣本進行脂多糖水平檢測。結果發現隨著年齡的增長，血漿脂多糖濃度逐漸升高。此外，在老年組和aged-FMT組大鼠中也發現了脂多糖水平的增加，表明脂多糖可能介導與老年相關的房顫的炎癥反應。

脂多糖主要通過激活TLR4蛋白的表達而導致促炎細胞因子的分泌，該蛋白在老年大鼠心房組織中的表達高于其他器官，老年人心房更易受脂多糖的影響。LPS-RS是一種有效的脂多糖拮抗劑，用于aged-FMT組大鼠后(1毫克/千克，每周一次，持續6周)，作者發現aged-FMT組大鼠房顫誘發率和房顫持續時間顯著降低；心房纖維化和纖維化相關蛋白的表達水平也通過脂多糖-受體顯著改善，證明老年微生物群通過升高的循環脂多糖促進對房顫的易感性。

圖2 老齡化過程中循環LPS水平的增加促進AF易感性

4. 老齡化菌群移植導致腸道屏障功能障礙

脂多糖是由大多數革蘭氏陰性菌的外膜囊泡產生的。然而，在aged-FMT組和young-FMT組之間的糞便中沒有發現革蘭氏陰性細菌豐度和脂多糖水平的差異，可能是腸道屏障的功能障礙導致這一結果。因此，作者研究了老年菌群移植是否改變腸道屏障的完整性。結果，近端結腸的HE 和 Masson染色顯示aged-FMT組大鼠絨毛長度較短，纖維化面積增加。作者用口服異硫氰酸熒光素(FITC)-葡聚糖測試腸滲透性，發現aged-FMT組大鼠的血清FITC葡聚糖水平明顯高于young-FMT組大鼠。

為了揭示在觀察到的腸道表型中微生物群-上皮細胞相互作用的潛在機制，作者對近端結腸組織樣本的蛋白質組學進行了深入分析。與aged-FMT組相比，共有179種蛋白(124種上調，55種下調)在young-FMT組的近端結腸組織樣本中顯著異常表達(FC> 2.0，P < 0.05)。

火山圖中顯示了差異表達蛋白質的概況。差異表達蛋白的具體數量如圖3F所示。KEGG通路分析表明，這些差異表達蛋白在33條途徑中富集，主要參與炎癥相關途徑。然后，作者進一步檢測了富集分析途徑的代表性蛋白的表達水平，包括aged-FMT組和young-FMT組大鼠近端結腸組織的ISG15、S100A8和S100A9，在老年糖尿病大鼠和人類老年志愿者中，炎癥相關標記物的表達水平顯著增加。炎癥過程與循環脂多糖升高有關，可能參與了腸通透性增加，并且這種增加功能可以通過老年相關微生物移植來轉移。

圖3 老年組菌群移植導致腸道屏障功能障礙和病理變化

5. 老齡化相關脂多糖通過激活心房NLRP 3-炎癥小體促進房顫

脂多糖誘導的TLR4激活被認為是介導NLRP 3-炎癥小體（參與多種年齡相關疾病的發生）表達的啟動信號。本研究中，雖然凋亡相關斑點樣蛋白(ASC)的蛋白表達水平保持不變，但aged-FMT組大鼠心房中NLRP3、促半胱天冬酶-1和活化半胱天冬酶-1的水平顯著增加。并且aged-FMT組大鼠的NLRP 3-炎癥小體成分上調，同時TLR4/pNFjB通路的激活增強，pNFjB增加。白細胞介素(IL)-1b也因老年組的菌群移植而顯著增加。表明NLRP3——炎癥體的“啟動”和“組裝”都被老年組的菌群移植激活。

為了驗證NLRP 3-炎癥小體對老年相關微生態失調誘導的房顫的刺激作用，作者給aged-FMT組大鼠服用選擇性炎癥體抑制劑MCC950，以中斷NLRP 3-炎癥體復合物的組裝。MCC950顯著降低aged-FMT組大鼠心房NLRP3通路的表達水平。一系列實驗數據表明，老年微生物群通過circulating LPS誘導NLRP3升高，最終增強心房纖維化而導致房顫。

圖4 老年腸道菌群失調通過激活NLRP3通路促進AF易感性

6. 葡萄糖過量增強NLRP 3-炎癥小體活性

NLRP3炎癥小體可以被激活以響應結構多樣的損傷相關分子模式，作者推測葡萄糖可能參與了與老齡化相關的AF的發展。結果表明老年大鼠的OGTT明顯高于年輕大鼠，并且可通過FMT轉移，可推測老年微生物群失調導致葡萄糖耐量受損。體外實驗中用原代大鼠心肌細胞（CMs）和心臟成纖維細胞（CFs）模擬老年房顫患者的病理內部環境。無論是LPS或HG（高糖處理）都不能單獨激活CFs中的NLRP 3-炎癥小體。CMs中LPS和HG對NLRP3炎癥小體的表達沒有影響。生理條件下，CF中TLR4的表達水平明顯高于CMs。LPS和HG也增加了CFs中纖維化蛋白的表達水平。通過免疫共沉淀檢測MCC950對CFs中NLRP3炎性小體活性的抑制作用。雖然NLRP3-ASC復合物的共定位不受影響，但NLRP3-Casp1-p20復合物的組裝被MCC950完全阻斷。

綜上所述，高糖是脂多糖激活心房NLRP 3-炎癥小體所必需的，并且CF中的TLR4易引發LPS或HG，這可以解釋隨著年齡的增長心房纖維化增強。

圖5 LPS和高糖增強NLRP3-炎性小體的激活

7. 長期健康年輕微生物群移植預防老年大鼠房顫

鑒于過量葡萄糖是脂多糖以TLR4方式增強CFs中NLRP 3-炎癥小體活性所必需的，作者隨后通過使用健康的年輕微生物群對老齡大鼠進行6個月的干預，評估了體內微生物群再定植對老齡相關性房顫的潛在治療效果。

首先，HE染色觀察到移植年輕大鼠糞便的老年大鼠(aged+young-FMT)在近端結腸中的絨毛長度比有自體糞便移植的老年大鼠(aged+aged-FMT)長。Masson染色說明在aged+young-FMT大鼠中也觀察到近端結腸纖維化面積減少。然后，作者發現移植年輕大鼠菌群的大鼠的血漿LPS升高和糖耐量受損有恢復趨勢。并且發現young-FMT心房NLRP 3-炎癥小體的激活顯著降低，心房纖維化和TGF-b1和α-平滑肌肌動蛋白的表達水平也因年輕菌群移植而減弱。此外，在被年輕菌群重新定植的老年大鼠未能成功誘導房顫，這表明長期年輕的FMT可通過抑制心房NLRP3-炎癥小體的活性來預防年齡相關性房顫的發生。

圖6 年輕組菌群移植通過抑制nlrp3炎癥小體信號通路防止AF易感性，恢復腸道屏障功能障礙

8. 老年臨床患者體內微生物代謝物和心房的病理變化

臨床數據方面，測量了從有房顫病史的老年患者(65歲以上)心房樣本中NLRP3、ASC、前胱天蛋白酶-1和活化胱天蛋白酶-1的蛋白水平。老年人和老年房顫患者心房中NLRP3炎癥體的表達水平顯著升高，而老年房顫患者的表達水平更高，表明NLRP 3-炎癥體的老年特異性表型與年齡相關性房顫的發病機制有關。在中年人群中，房顫的患病率隨著脂多糖水平的升高而呈上升趨勢，而在年輕人群中則沒有。

12012名合格臨床個體的OGTT結果中，隨著年齡的增長，男性和女性的HG水平都在上升，男性高于女性，這與房顫發病率的性別差異一致。此外，老年人類患者的絨毛較短，結腸組織過度纖維化。臨床數據進一步驗證了腸道菌群在老年房顫中的作用，并為針對腸道微生物在老年心血管疾病中的治療策略提供了更多的證據。

圖7 臨床個體心房及循環LPS、葡萄糖的病理改變