基因治療制造趨勢解析：高產能、可放大加速工業(yè)化生產
本文節(jié)選自《Gene Therapy Manufacturing Trends》，詳細內容，請參考原文。
基因和基因修飾細胞療法是生物制藥市場增長最快的領域之一。這些新藥物即使不能完全治愈曾經被認為是無法治愈的疾病，也極有可能緩和這些疾病的影響。已有多家公司在臨床試驗和市場上取得了成功，而更多大大小小的開發(fā)商正在吸引大量的投資，旨在加速其產品審批和商業(yè)化進程。
事實上，根據再生醫(yī)學聯(lián)盟的數(shù)據，盡管出現(xiàn)了COVID-19大流行，但2020年用于再生藥物和先進療法的資金達到了創(chuàng)紀錄的199億美元，其中基因療法的資金增長了73%。在全球范圍內活躍的、基于組織的治療方法進行了超過1,200項臨床試驗(比前一年多約100項)，其中31.5%處于I期，56%處于II期，12.5%處于III期。
另外，有兩項基因療法在2020年獲得批準：Orchard Therapeutics的基因療法Libmeldy獲得了歐洲藥品管理局(EMA)的批準，Kite Pharma的嵌合抗原受體T細胞(CAR-T)療法獲得了美國食品藥品管理局(FDA)的批準。預計2021年將針對8種新的再生藥物產品作出8項額外的監(jiān)管決定。
早在2019年，F(xiàn)DA就曾預計，其每年將收到超過200個細胞和基因療法的研究性新藥申請，到2025年，每年將有10到20個細胞和基因療法產品獲得批準。
工藝即產品
然而，監(jiān)管部門正在密切關注基因和細胞治療的生產，因為正如人們經常指出的那樣，“工藝即產品”。基因和基因修飾細胞療法是利用病毒載體生產的。對于基因療法來說，載體就是療法，作為目的基因的傳遞工具，前者將用于取代缺失或功能失調的基因。在基因修飾細胞治療中，例如CAR- T細胞治療，病毒載體被用來將遺傳物質遞送到細胞中，以某種方式對其進行改造，從而增強或提高生物活性。
最常用的病毒載體是腺相關病毒(AAV)和慢病毒(LV)，但腺病毒和一些逆轉錄病毒也被用于基因和基因修飾細胞治療候選療法臨床管線。
這些病毒載體是通過細胞培養(yǎng)產生的，通常是用質粒DNA轉染哺乳動物細胞(典型為HEK293)，但在某些情況下(如AAV)是通過同時感染桿狀病毒昆蟲細胞體系，或使用人類來源的單純皰疹病毒(HSV) 1型系統(tǒng)。
更穩(wěn)定的包裝和生產細胞系已經開發(fā)并在某些情況下使用，但這些解決方案需要更長的開發(fā)時間，需要顯著的更多優(yōu)化工作，才能被更高廣泛地使用。
對于基因療法來說，需要最大限度地縮短進入臨床試驗的時間，而更重要的是縮短進入市場的時間，因為第一個推出的產品將主導市場；與單克隆抗體不同的是，后來者獲得市場份額的機會更低。
因此，最初的重點是展示藥物療效，而不是工藝效率、穩(wěn)健性和可放大性。事實上，許多最初在實驗室規(guī)模上通過靜態(tài)塑料器皿開發(fā)的基因治療方法，足以用于發(fā)現(xiàn)工作，甚至用于早期臨床試驗物料的生產。然而，它們通常需要大量的手動操作，不適合大規(guī)模使用。
最初專注于懸浮細胞培養(yǎng)
大多數(shù)基因療法，包括今天正在發(fā)展當中的那些，開始使用貼壁細胞培養(yǎng)工藝，盡管對于臨床前階段來說，貼壁細胞復雜且昂貴，但其提供了一種快速發(fā)現(xiàn)、開發(fā)和進入臨床的手段。
然而，重組蛋白和單克隆抗體(mAb)的傳統(tǒng)生物制造工藝是在攪拌罐反應器(STR)的懸浮進行的。這些反應器最初被開發(fā)用于化學工業(yè)，然后被用于釀造，最后被用于生物制品的生產。對于mAb，其提供了許多優(yōu)點，包括可放大性以及眾所周知的流體動力學行為，這允許實現(xiàn)自動控制和高水平的再現(xiàn)性。在過去的幾十年里，中國倉鼠卵巢(CHO)細胞在懸浮細胞培養(yǎng)中表現(xiàn)良好，提供了穩(wěn)健且高產的細胞系，能夠產生比初始細胞系顯著更高的滴度。
用于懸浮細胞培養(yǎng)工藝的STR越來越多地使用一次性使用系統(tǒng)，且其可以很容易地實現(xiàn)從mL到6,000 L或更大的規(guī)模。接種液首先在搖瓶中制備，然后在較小的生物反應器中以10倍每步的步驟提高接種液的體積，直到獲得所需的接種量。
攪拌罐生物反應器的局限性
然而，STR懸浮細胞培養(yǎng)在病毒載體生產方面存在局限性。任何類型的細胞培養(yǎng)都需要適當?shù)臐舛龋员阃ㄟ^分泌和吸收各種輔助因子使細胞之間能夠“交流”。由于STR中的濃度效應，生產性生物反應器必須在高濃度下接種 - 比最初的貼壁工藝要高得多 – 這會帶來額外的時間和成本。
懸浮細胞是由貼壁細胞“改造”而來的。由于它們不是在它們的自然狀態(tài)，它們的行為方式不同，而且往往比它們的貼壁“同行”提供更低的產量。HEK293細胞適應懸液的工作只進行了幾年，而不是幾十年，因此，它們在大規(guī)模生產時往往不那么“健壯”，因此在規(guī)模放大方面仍然存在許多挑戰(zhàn)。
用質粒DNA轉染HEK293細胞需要均勻混合才能有效，但在大型STR內實現(xiàn)均勻混合是困難的，因為混合效率隨規(guī)模擴大而降低。攪拌和氣體流動速率(氧氣鼓泡，導致大的、分散氣泡的存在)必須非線性地增加，以計入罐總體積 (m3) 與可用于熱和氣體傳輸?shù)谋砻?m2)之比的增加。更高的攪拌意味著更高的機械力和更高的局部氧化應激風險。
用于病毒載體生產的哺乳動物細胞對這些在大型STR中普遍存在的剪切和氧化應激敏感。剪切應力也會破壞質粒DNA和質粒DNA-轉染劑復合物，從而在泵送和實際工藝中需要注意。
剪切應力和氧化應激都對會這一過程產生負面影響。這通常需要更多的開發(fā)工作來將懸浮病毒載體工藝從實驗室轉移到中試工廠，再轉移到商業(yè)化生產，而產量通常還仍不是最優(yōu)的。
此外，典型的實驗室規(guī)模轉染工藝需要重復清洗轉染混合物。這在STR的大規(guī)模懸浮工藝中是不可行的，因為它將需要處理成百上千升的液體。為了避免這個問題，要么通過過濾方法濃縮細胞，要么不清洗直接將轉染混合物加入細胞培養(yǎng)中 - 這兩種方法都會增加時間和成本。
行業(yè)對使用灌流細胞培養(yǎng)作為維持更長的細胞培養(yǎng)時間、而達到更高產量的手段的興趣正在增加。在STR中，灌流需要使用外部細胞截留裝置，但需要選擇低剪切的技術，以降低對細胞的應激。（相關閱讀：灌流中，ATF平均剪切低于TFF：低剪切提高重組蛋白生產，高剪切增加細胞凋亡）
固定床生物反應器中的貼壁細胞培養(yǎng)
在固定床反應器(FBR)中進行的貼壁細胞培養(yǎng)提供了一種替代在STR中進行懸浮培養(yǎng)的方式。固定在“床”上的細胞與液體培養(yǎng)基“分離”，允許在不影響細胞的情況下優(yōu)化工藝參數(shù)。具體來說，F(xiàn)BR包含一個固體但可滲透的支持基質，促進貼壁細胞的均勻分布，并在最小的機械或氧化應力下，溫和循環(huán)或灌流培養(yǎng)基，促使FBR獲得更高的生長和生產力。
與STR相比，固定床的設計支持幾乎相同的細胞數(shù)量和產量，而體積減少了100倍。更小的體積意味著更緊湊的占地面積，50 L FBR的產量相當于1,000 L或更大的STR。
FBR中更高的細胞密度也大大減少了所需的接種數(shù)量，從而降低了種子生產的操作負擔。由于細胞被“床”自然截留，F(xiàn)BR也可實現(xiàn)灌流工藝，因為不需要復雜的細胞截留裝置，這降低了工藝的復雜性和成本，同時也降低了細胞暴露于剪切應激的可能性。
此外，罐體積與氣體和熱交換表面的比例在規(guī)模放大或縮小時變化不大，即更容易維持罐內的均勻狀態(tài)。這一特性也簡化了轉染過程，可以直接從小規(guī)模轉移到大規(guī)模，而不需要細胞濃縮、稀釋或重新開發(fā)轉染混合物。
FBR的這一特性可方便利用一次性使用技術以及高水平的自動化和控制，實現(xiàn)了從實驗室到工業(yè)規(guī)模的線性可放大性，從而在降低風險的情況下實現(xiàn)更快速的開發(fā)和商業(yè)化。
值得注意的是，在貼壁FBR工藝中，接種液的制備首先是在扁平培養(yǎng)容器中進行，然后在多層培養(yǎng)容器中放大。當產量足夠多時，細胞酶解分離，以接種FBR。為了促進細胞在整個固定床上的均勻分布，必須確保細胞作為單個單元存在。如果剪切敏感型病毒載體為胞外生產，應特別小心，因其生產后將在FBR中循環(huán)。
FBR在載體制造中的應用
Univercells Technologies開發(fā)了scale-X FBR產品組合，以方便現(xiàn)有貼壁工藝的轉移和縮放。scale-X hydro (2.4 m2)、scale-X carbo(10-30 m2)和scale-X nitro(200-600 m2)分別支持基因和基因修飾細胞療法的工藝開發(fā)、中試規(guī)模、中 - 大規(guī)模工業(yè)生產和大規(guī)模工業(yè)生產。scale-X生物反應器產品也被證明適用于基于懸浮的工藝。在這種情況下，懸浮細胞被捕獲在固定床中，從而可以在不影響工藝質量或生產率的情況下，從基于懸浮的工藝直接轉移到scale-X FBR。
這種設計的結果是在與靜態(tài)塑料器皿類似的條件下，實現(xiàn)培養(yǎng)基在細胞間的溫和循環(huán)。一個緊密排列的支撐矩陣由卷式無紡布聚對苯二甲酸乙二醇酯(PET)織物層組成，允許在小占地的生物反應器中實現(xiàn)高細胞密度。磁性離心葉輪可提供良好混合，以確保整個固定床中營養(yǎng)物的可用性，系統(tǒng)通過罐頂部空間的“降膜”通氣，以提高可用于氣體交換的表面積，并在垂直和水平兩個方向實現(xiàn)一致的環(huán)境。
液體培養(yǎng)基通過固定床的線速度在不同規(guī)模上保持不變，因此，細胞經歷類似的低剪切條件。自動化程度高的同時，保證了關鍵工藝參數(shù)的控制。
滿足大規(guī)模病毒載體制造需求
攪拌罐生物反應器的基本力學和操作約束可能導致工藝開發(fā)時間的延長，并影響生產率、效率和成本。雖然懸浮細胞培養(yǎng)被廣泛用于生產病毒載體，但要實現(xiàn)真正的工業(yè)化，還需要更可靠、可放大的解決方案。隨著貼壁工藝和懸浮工藝的不斷進步，支持這兩種方法的平臺將通過分離工藝和技術來優(yōu)化生產率和響應時間。
固定床生物反應器中的細胞培養(yǎng)為大規(guī)模生產病毒載體提供了解決方案，并將在促進大量低成本基因和基因修飾細胞療法的制造方面發(fā)揮關鍵作用。使用scale-X FBR，早期開發(fā)工藝可以使用更簡單的流程，直接轉移到占地面積更小的一次性使用設備中，并獲得更高的生產率和產量。
此外，最近正在進行的關于scale-X FBR在懸浮細胞培養(yǎng)中用于病毒載體制造的適用性的研究表明，這種一次性使用生物反應器技術也為利用懸浮工藝的基因治療開發(fā)商提供了好處。具體數(shù)據將很快公布。
原文：A.Chatel, Gene Therapy Manufacturing Trends. Contract Pharma, 2021.
相關閱讀：
基因和基因修飾細胞療法是生物制藥市場增長最快的領域之一。這些新藥物即使不能完全治愈曾經被認為是無法治愈的疾病，也極有可能緩和這些疾病的影響。已有多家公司在臨床試驗和市場上取得了成功，而更多大大小小的開發(fā)商正在吸引大量的投資，旨在加速其產品審批和商業(yè)化進程。
事實上，根據再生醫(yī)學聯(lián)盟的數(shù)據，盡管出現(xiàn)了COVID-19大流行，但2020年用于再生藥物和先進療法的資金達到了創(chuàng)紀錄的199億美元，其中基因療法的資金增長了73%。在全球范圍內活躍的、基于組織的治療方法進行了超過1,200項臨床試驗(比前一年多約100項)，其中31.5%處于I期，56%處于II期，12.5%處于III期。
另外，有兩項基因療法在2020年獲得批準：Orchard Therapeutics的基因療法Libmeldy獲得了歐洲藥品管理局(EMA)的批準，Kite Pharma的嵌合抗原受體T細胞(CAR-T)療法獲得了美國食品藥品管理局(FDA)的批準。預計2021年將針對8種新的再生藥物產品作出8項額外的監(jiān)管決定。
早在2019年，F(xiàn)DA就曾預計，其每年將收到超過200個細胞和基因療法的研究性新藥申請，到2025年，每年將有10到20個細胞和基因療法產品獲得批準。
工藝即產品
然而，監(jiān)管部門正在密切關注基因和細胞治療的生產，因為正如人們經常指出的那樣，“工藝即產品”。基因和基因修飾細胞療法是利用病毒載體生產的。對于基因療法來說，載體就是療法，作為目的基因的傳遞工具，前者將用于取代缺失或功能失調的基因。在基因修飾細胞治療中，例如CAR- T細胞治療，病毒載體被用來將遺傳物質遞送到細胞中，以某種方式對其進行改造，從而增強或提高生物活性。
最常用的病毒載體是腺相關病毒(AAV)和慢病毒(LV)，但腺病毒和一些逆轉錄病毒也被用于基因和基因修飾細胞治療候選療法臨床管線。
這些病毒載體是通過細胞培養(yǎng)產生的，通常是用質粒DNA轉染哺乳動物細胞(典型為HEK293)，但在某些情況下(如AAV)是通過同時感染桿狀病毒昆蟲細胞體系，或使用人類來源的單純皰疹病毒(HSV) 1型系統(tǒng)。
更穩(wěn)定的包裝和生產細胞系已經開發(fā)并在某些情況下使用，但這些解決方案需要更長的開發(fā)時間，需要顯著的更多優(yōu)化工作，才能被更高廣泛地使用。
對于基因療法來說，需要最大限度地縮短進入臨床試驗的時間，而更重要的是縮短進入市場的時間，因為第一個推出的產品將主導市場；與單克隆抗體不同的是，后來者獲得市場份額的機會更低。
因此，最初的重點是展示藥物療效，而不是工藝效率、穩(wěn)健性和可放大性。事實上，許多最初在實驗室規(guī)模上通過靜態(tài)塑料器皿開發(fā)的基因治療方法，足以用于發(fā)現(xiàn)工作，甚至用于早期臨床試驗物料的生產。然而，它們通常需要大量的手動操作，不適合大規(guī)模使用。
最初專注于懸浮細胞培養(yǎng)
大多數(shù)基因療法，包括今天正在發(fā)展當中的那些，開始使用貼壁細胞培養(yǎng)工藝，盡管對于臨床前階段來說，貼壁細胞復雜且昂貴，但其提供了一種快速發(fā)現(xiàn)、開發(fā)和進入臨床的手段。
然而，重組蛋白和單克隆抗體(mAb)的傳統(tǒng)生物制造工藝是在攪拌罐反應器(STR)的懸浮進行的。這些反應器最初被開發(fā)用于化學工業(yè)，然后被用于釀造，最后被用于生物制品的生產。對于mAb，其提供了許多優(yōu)點，包括可放大性以及眾所周知的流體動力學行為，這允許實現(xiàn)自動控制和高水平的再現(xiàn)性。在過去的幾十年里，中國倉鼠卵巢(CHO)細胞在懸浮細胞培養(yǎng)中表現(xiàn)良好，提供了穩(wěn)健且高產的細胞系，能夠產生比初始細胞系顯著更高的滴度。
用于懸浮細胞培養(yǎng)工藝的STR越來越多地使用一次性使用系統(tǒng)，且其可以很容易地實現(xiàn)從mL到6,000 L或更大的規(guī)模。接種液首先在搖瓶中制備，然后在較小的生物反應器中以10倍每步的步驟提高接種液的體積，直到獲得所需的接種量。
攪拌罐生物反應器的局限性
然而，STR懸浮細胞培養(yǎng)在病毒載體生產方面存在局限性。任何類型的細胞培養(yǎng)都需要適當?shù)臐舛龋员阃ㄟ^分泌和吸收各種輔助因子使細胞之間能夠“交流”。由于STR中的濃度效應，生產性生物反應器必須在高濃度下接種 - 比最初的貼壁工藝要高得多 – 這會帶來額外的時間和成本。
懸浮細胞是由貼壁細胞“改造”而來的。由于它們不是在它們的自然狀態(tài)，它們的行為方式不同，而且往往比它們的貼壁“同行”提供更低的產量。HEK293細胞適應懸液的工作只進行了幾年，而不是幾十年，因此，它們在大規(guī)模生產時往往不那么“健壯”，因此在規(guī)模放大方面仍然存在許多挑戰(zhàn)。
用質粒DNA轉染HEK293細胞需要均勻混合才能有效，但在大型STR內實現(xiàn)均勻混合是困難的，因為混合效率隨規(guī)模擴大而降低。攪拌和氣體流動速率(氧氣鼓泡，導致大的、分散氣泡的存在)必須非線性地增加，以計入罐總體積 (m3) 與可用于熱和氣體傳輸?shù)谋砻?m2)之比的增加。更高的攪拌意味著更高的機械力和更高的局部氧化應激風險。
用于病毒載體生產的哺乳動物細胞對這些在大型STR中普遍存在的剪切和氧化應激敏感。剪切應力也會破壞質粒DNA和質粒DNA-轉染劑復合物，從而在泵送和實際工藝中需要注意。
剪切應力和氧化應激都對會這一過程產生負面影響。這通常需要更多的開發(fā)工作來將懸浮病毒載體工藝從實驗室轉移到中試工廠，再轉移到商業(yè)化生產，而產量通常還仍不是最優(yōu)的。
此外，典型的實驗室規(guī)模轉染工藝需要重復清洗轉染混合物。這在STR的大規(guī)模懸浮工藝中是不可行的，因為它將需要處理成百上千升的液體。為了避免這個問題，要么通過過濾方法濃縮細胞，要么不清洗直接將轉染混合物加入細胞培養(yǎng)中 - 這兩種方法都會增加時間和成本。
行業(yè)對使用灌流細胞培養(yǎng)作為維持更長的細胞培養(yǎng)時間、而達到更高產量的手段的興趣正在增加。在STR中，灌流需要使用外部細胞截留裝置，但需要選擇低剪切的技術，以降低對細胞的應激。（相關閱讀：灌流中，ATF平均剪切低于TFF：低剪切提高重組蛋白生產，高剪切增加細胞凋亡）
固定床生物反應器中的貼壁細胞培養(yǎng)
在固定床反應器(FBR)中進行的貼壁細胞培養(yǎng)提供了一種替代在STR中進行懸浮培養(yǎng)的方式。固定在“床”上的細胞與液體培養(yǎng)基“分離”，允許在不影響細胞的情況下優(yōu)化工藝參數(shù)。具體來說，F(xiàn)BR包含一個固體但可滲透的支持基質，促進貼壁細胞的均勻分布，并在最小的機械或氧化應力下，溫和循環(huán)或灌流培養(yǎng)基，促使FBR獲得更高的生長和生產力。
與STR相比，固定床的設計支持幾乎相同的細胞數(shù)量和產量，而體積減少了100倍。更小的體積意味著更緊湊的占地面積，50 L FBR的產量相當于1,000 L或更大的STR。
FBR中更高的細胞密度也大大減少了所需的接種數(shù)量，從而降低了種子生產的操作負擔。由于細胞被“床”自然截留，F(xiàn)BR也可實現(xiàn)灌流工藝，因為不需要復雜的細胞截留裝置，這降低了工藝的復雜性和成本，同時也降低了細胞暴露于剪切應激的可能性。
此外，罐體積與氣體和熱交換表面的比例在規(guī)模放大或縮小時變化不大，即更容易維持罐內的均勻狀態(tài)。這一特性也簡化了轉染過程，可以直接從小規(guī)模轉移到大規(guī)模，而不需要細胞濃縮、稀釋或重新開發(fā)轉染混合物。
FBR的這一特性可方便利用一次性使用技術以及高水平的自動化和控制，實現(xiàn)了從實驗室到工業(yè)規(guī)模的線性可放大性，從而在降低風險的情況下實現(xiàn)更快速的開發(fā)和商業(yè)化。
值得注意的是，在貼壁FBR工藝中，接種液的制備首先是在扁平培養(yǎng)容器中進行，然后在多層培養(yǎng)容器中放大。當產量足夠多時，細胞酶解分離，以接種FBR。為了促進細胞在整個固定床上的均勻分布，必須確保細胞作為單個單元存在。如果剪切敏感型病毒載體為胞外生產，應特別小心，因其生產后將在FBR中循環(huán)。
FBR在載體制造中的應用
Univercells Technologies開發(fā)了scale-X FBR產品組合，以方便現(xiàn)有貼壁工藝的轉移和縮放。scale-X hydro (2.4 m2)、scale-X carbo(10-30 m2)和scale-X nitro(200-600 m2)分別支持基因和基因修飾細胞療法的工藝開發(fā)、中試規(guī)模、中 - 大規(guī)模工業(yè)生產和大規(guī)模工業(yè)生產。scale-X生物反應器產品也被證明適用于基于懸浮的工藝。在這種情況下，懸浮細胞被捕獲在固定床中，從而可以在不影響工藝質量或生產率的情況下，從基于懸浮的工藝直接轉移到scale-X FBR。
這種設計的結果是在與靜態(tài)塑料器皿類似的條件下，實現(xiàn)培養(yǎng)基在細胞間的溫和循環(huán)。一個緊密排列的支撐矩陣由卷式無紡布聚對苯二甲酸乙二醇酯(PET)織物層組成，允許在小占地的生物反應器中實現(xiàn)高細胞密度。磁性離心葉輪可提供良好混合，以確保整個固定床中營養(yǎng)物的可用性，系統(tǒng)通過罐頂部空間的“降膜”通氣，以提高可用于氣體交換的表面積，并在垂直和水平兩個方向實現(xiàn)一致的環(huán)境。
液體培養(yǎng)基通過固定床的線速度在不同規(guī)模上保持不變，因此，細胞經歷類似的低剪切條件。自動化程度高的同時，保證了關鍵工藝參數(shù)的控制。
滿足大規(guī)模病毒載體制造需求
攪拌罐生物反應器的基本力學和操作約束可能導致工藝開發(fā)時間的延長，并影響生產率、效率和成本。雖然懸浮細胞培養(yǎng)被廣泛用于生產病毒載體，但要實現(xiàn)真正的工業(yè)化，還需要更可靠、可放大的解決方案。隨著貼壁工藝和懸浮工藝的不斷進步，支持這兩種方法的平臺將通過分離工藝和技術來優(yōu)化生產率和響應時間。
固定床生物反應器中的細胞培養(yǎng)為大規(guī)模生產病毒載體提供了解決方案，并將在促進大量低成本基因和基因修飾細胞療法的制造方面發(fā)揮關鍵作用。使用scale-X FBR，早期開發(fā)工藝可以使用更簡單的流程，直接轉移到占地面積更小的一次性使用設備中，并獲得更高的生產率和產量。
此外，最近正在進行的關于scale-X FBR在懸浮細胞培養(yǎng)中用于病毒載體制造的適用性的研究表明，這種一次性使用生物反應器技術也為利用懸浮工藝的基因治療開發(fā)商提供了好處。具體數(shù)據將很快公布。
原文：A.Chatel, Gene Therapy Manufacturing Trends. Contract Pharma, 2021.
相關閱讀：
標簽：
基因修飾 細胞療法 病毒載體
Copyright(C) 1998-2025 生物器材網 電話：021-64166852;13621656896 E-mail：info@bio-equip.com