多重分析，即在單個反應中檢測多個靶標，可以幫助用戶節省寶貴的樣品，并節省時間、試劑和成本。此外，和做多次單重實驗相比，由于多重反應所有靶標都在同一個反應中進行擴增和檢測，使得樣品和試劑的移液操作誤差減少，因此多重檢測可以提高定量精度。naica^®微滴芯片數字PCR系統的多重檢測與單重檢測一樣靈敏和精準。專業的分析設計和優化可以實現更復雜的多重檢測，從而在單個PCR反應中用多對引物和探針擴增多個DNA目標。Crystal Miner軟件是一個開放的數據分析軟件，可以通過其提供的強大工具來幫助優化和完成多重分析。
 

評估引物和探針性能的實驗指南

1.Stilla建議使用naica^® multiplex PCR mix，該試劑設計的初衷是為了得到更好的多重naica^®微滴芯片數字PCR系統的實驗數據。

2.單重反應測試。在進行多重反應之前，每個引物/探針/模板均需要進行單重性能驗證。例如，對于三重分析，在多重反應混合進行之前，首先應對核酸靶標進行三個單重反應。當進行單重反應時，預期結果只出現單一陽性。

3.為了優化多重分析性能，樣品性質也是十分重要的因素(例如，游離DNA和基因組DNA需要設計不同的DNA片段，分析游離DNA需要設計成短片段DNA，分析基因組DNA需要設計更完整的DNA片段)。

4.使用的DNA模板應該沒有污染物和可能的抑制劑。如果樣品材料稀少或不容易獲得，可以合成寡核苷酸作為模板分析優化。

5. 評估每個單重反應的退火溫度范圍，在最佳反應溫度下，陽性和陰性微滴分離良好且沒有非特異性擴增(圖1)。由Crystal Miner軟件(圖2)提供的Stilla可分離評價可以作為一種度量標準，用于確定所有探針的最佳退火溫度。如果單重反應沒有被很好地優化，可能會出現明顯的非特異性擴增。此外，非特異性擴增可能由幾個非優化參數造成。包括引物/探針二聚體或引物/探針非特異性。在這種情況下，可以采用多種方法限制非特異性序列的擴增，如提高退火溫度、進行touch down PCR或重新設計引物序列等。實驗前可使用相關軟件評估引物探針的特異性。

▲圖1 ：Crystal Miner軟件展示單重反應一維點狀圖，在60°C到65°C退火溫度內， 藍色、綠色和紅色熒光通道檢測到的熒光強度。黑框部分表示單重反應的最佳退火溫度。可分性評分(e)可用于確定3個靶標擴增的最佳退火溫度。(帶*數字為可分性評分)
 

▲圖2 ：可分性評分是基于陽性和陰性微滴群體的距離。可分性評分是由Crystal Miner軟件自動計算，并可以在高級QC標簽欄下找到。
 

6.在選定的退火溫度下，使用所有引物和探針進行多重naica^®微滴芯片數字PCR系統，并以區分度為指導，評估反應性能。如果有需要，可從以下幾點優化:

★ 調整PCR的循環數——建議從45個循環開始，并增加循環數，以進一步優化陽性和陰性微滴群體之間的分離度。

★ 調整引物和探針濃度——naica®微滴芯片數字PCR系統推薦的引物和探針濃度范圍可從0.125到1μM (圖3)。對于多重分析的設計建議從較低的濃度范圍開始,以減少反應的復雜性,減少引物和探針所占據的體積。
 

▲圖3。Crystal Miner軟件的一維點狀圖顯示了一系列引物(左圖)和探針(右圖)濃度不斷增加時藍色檢測通道中的熒光強度。黑框部分表示良好的可分性評分，及在低引物探針濃度的選擇標準下確定的用于多重分析的引物探針濃度。(帶*數字為可分性評分)
 

★ 使用修飾的堿基，如鎖核苷酸(LNA)堿基或小溝結合基團(MGB)，以提高探針的Tm值，同時保持較短的長度(可能<20nt)。然而，在多重檢測中建議探針添加的MGB不超過2個，以避免擴增減少。

7.評價引物和探針的相互作用：在同一個多重實驗中引物和/或探針之間形成同源/異源二聚體的概率應保持在最低。二聚體是可以評估的，相互作用的分數可以用多種工具來確定(例如，IDT Oligo Analyzer Tool, Primer 3, Primer express, Beacon designer) (圖4)。高濃度的引物和探針會增加非特異性相互作用的概率。因此，多重分析時，建議所有檢測都從低濃度的引物開始(例如，0.25 uM)，如果需要，逐步增加濃度至1 uM(例如，提高擴增效率)。
 

▲圖4：引物和探針之間的相互作用示例。a)target 1的探針與target 2的反向引物相互作用(R2 target 2，紅框)。當使用反向引物RI target 2時，沒有檢測到這種相互作用。在本例中，應選擇RI target 2進行多重檢測。b) target 1的探針與target 2的正向引物的相互作用(F2 target 2. 藍框)。當使用正向引物F1 target 2時，沒有檢測到這種相互作用。在本例中，FI target 2應被選擇用于多重檢測。
 

8.對于多重分析，熒光溢出補償是十分重要的。使用多個單色參照，Crystal Miner軟件可以創建一個補償模型用于特定的多重反應。有關熒光溢出的更詳細描述,請訪問https://www.gene-pi.com/item/spill-over-2/。執行熒光溢出補償的操作說明請參考Crysta Miner軟件用戶手冊。
 

naica^®微滴芯片數字PCR系統

naica^®微滴芯片數字PCR系統，以Sapphire芯片（全自動）或Opal（高通量）芯片為耗材，形成25,000-30,000個微滴的2D陣列，以單層平鋪方式進行PCR擴增實驗。反應完成后對微滴進行三色通道或六色通道檢測，從而對起始核酸濃度進行絕對定量。2.5小時內，可快速獲得結果。